用于检测和定量分析极性细胞代谢物的一种新颖的HILICLCMS方法

1、用于检测和定量分析极性细胞代谢物的一种新颖的HILIC LC-MS方法来源：沃特世公司阅读数:61时间：2011-04-20引言复杂生物样品通常包含大量可反映有机体代谢状态的内源性代谢物。特别是骨骼肌可根据其是快收缩肌 （白色肌肉，糖酵解型）还是慢收缩肌（红色肌肉，氧化型）而表现出特征性的代谢组“指纹图谱”。例如， 红色肌肉应显示一种富含线粒体代谢物（如三羧酸循环）的代谢组指纹图谱；而白色肌肉应显示富含糖 酵解代谢物的代谢组指纹图谱，其线粒体代谢物的浓度大大低于红色肌肉。虽然很多这类代谢物可具有 较强的极性，但这些样本通常使用反相液相色谱-质谱（RP-LC-MS）进行分析，由此而来的多是较差的

2、 保留。在本研究中，我们开发了一种用于检测和定量强极性细胞代谢物的新颖LC-MS方法。本研究采用 了基于亚2微米颗粒BEH酰胺柱的亲水作用液相色谱（HILIC），并联用了杂化四极杆飞行时间质谱仪 和三重四极杆质谱。方法这些试验借助联用了沃特世SynaptTM HDMSTM、沃特世Synapt G2 HDMS和Xevo TQ的一台UPLC系 统而进行：液相色谱条件（1）:使用碱性流动相液相色谱系统：沃特世ACQUITY UPLC系色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide 酰胺基柱，2.1x100mm，1.7m柱温：45 C流速：500口L/分钟碱性流动相A：乙腈/水，95/5 （v/

3、v），10mM醋酸铵，pH=9.0碱性流动相B：乙腈/水，50/50 （v/v），10mM醋酸铵，pH=9.0梯度（采用碱性流动相进行分离时）：线性梯度，先用2% B - 85% B洗脱8分钟，然后在98% B的水平 下保持2分钟，接着返回到2% B的水平进行再平衡（5分钟）进样量：5-20队液相色谱条件（2）:使用酸性流动相液相色谱系统：沃特世ACQUITY UPLC系统色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide 酰胺基柱，2.1x100mm，1.7m柱温：40 C流速：600口L/分钟酸性流动相A：乙腈/水，95/5 （v/v），10mM醋酸铵，pH=3.0酸性流动相B：水，10

4、mM醋酸铵，pH=3.0一梯度：先用5% B - 30% B洗脱5分钟，在第5.5min时升至60% B并保持7分钟，接着返回到5% B 的水平进行再平衡（5分钟）进样量：20|jL满定量环质谱分析Synapt HDMS 和 Synapt G2 HDMS该质谱仪在正离子MSE模式下运行。所用的毛细管电压为3.0kV，源温度和去溶剂化温度分别被设定为 120C和 400Co在MSE采集模式下，仪器交替在低、高碰撞能量状态下进行交替扫描。这样可在一次分析内同时收集所 有分析物的母离子和碎片离子的信息，消除了诸如DDA等其它常规方法所带来的采样偏差；在常规方法 中，特定的m/z必须在碎片化前被分离出

5、来。Xevo-TQ 质谱Xevo TQ可同时在正离子和负离子模式下运行。毛细管电压为3.0kV，源温度和去溶剂化温度分别被设 定为150C和650C。去溶剂化气体流速被设定为1200L/小时，碰撞气体（氩）的流速为0.18mL/分 钟（4x10-3毫巴）。MS1/MS2分辨率被设置为单位质量（0.75Da FWHM）。组织提取物的样品制备红色的比目鱼肌（S）用来与白色的腓肠肌（G）进行比较，肌肉从禁食一整夜的BALB/c小鼠中切下并 进行了急速冷冻。代谢物通过组织均质化的方法在1:1的甲醇：水混合溶剂中进行萃取，脂质通过将氯 仿以1:1的比例添加至甲醇/水萃取液中而得到去除。去脂质后的组织萃取

6、样本分别用400此和4000此 的90:10乙腈：水混合溶剂进行挥干复溶。由于某些组分的含量高于定量上限，因此也对每份样本再稀 释10倍进行了分析。结果和讨论1.通过联用Synapt HDMS的UPLC进行HILIC LC-MS方法开发图1. 108种标准强极性细胞代谢物的总离子色谱图，其中包括氨基酸帅衲4碱基及其磷酸盐、辅 酶A、B族维生素、有机酸等。图1给出了 108种标准强极性细胞代谢物的总离子色谱图（TIC），其中包括氨基酸、DNA/RNA碱基及其磷酸盐、辅酶A、B族维生素、有机酸等。此项试验通过联用沃特世Synapt HDMS （正离子MSE模式下）的沃特世UPLC【液相色谱条件（1

7、）】而进行。SS2.单 f 会础心子色备图和丽口国专口内2.使用UPLC / Xevo-TQ联用仪器对HILIC LC-MS方法开发标准品和细胞莘取物进行定量分析在UPLC优化过程中进行的标准品分析表明使用酸性pH的流动相缓冲液可提高对氨基酸 和有机酸的分辨率、信噪比和峰对称性。图3比较了对一种包含约2口g/mL L-赖氨酸的纯 氨基酸溶液所得出的两幅MRM色谱图。靠上的色谱图通过使用碱性流动相（液相色谱条 件1）所进行的分离而得出，而靠下的色谱图则采用酸性流动相（液相色谱条件2）。图3.比较不同pH下，包含约2“g仞LL-赖氨酸溶液的两幅MAM色谱图图4.液相色谱条件但）得出的MRM色谱图示

8、例图4将酸性流动相（液相色谱条件（2）下1600ng/mL校准标准品（上图）和样本H-S （0090）的MRM色谱图进行了叠加。在此条件下，我们成功分离并定量分析了 28种化合物，其中包括氨基酸、有机酸和磷酸盐（图6）。图5. TargetLynx给出的ADP电子报告示例43种化合物的定量分析（既包括酸性也包括碱性条件）使用TargetLynxTM进行。对于每种化合物，均 生成了相应的电子报告；计算结果通过线性回归进行确定。图5是腺苷二磷酸（ADP，在三羧酸循环中 特别重要）的一个报告示例。jit-a图6.使用碱性（左表）和酸性（右表）流动相在S和H-G组织样本中所检出化合物的浓度计算结果 总

9、合对在碱性和酸性流动相分离中所检出的H-S和H-G组织样本中的每种化合物均计算了分析物浓度。通过 比较红色比目鱼肌（S）和腓肠肌（G）组织样本中的代谢物浓度证实了在其相对浓度方面存在显著差异。3.通过联用Synapt G2的UPLC对HILIC LC-MS方法的标准品和细胞萃取物进行定量分析最近开发的用于Synapt G2的QuanTof技术以及MSE数据采集技术的应用实现了一种通用型 UPLC-MS方法的开发；这种方法可在一次运行分析得到提供所有物质的定量和定性信息，既包括母离 子信息也包括产物离子的信息。对于此项测定而言，系列稀释标准品以及H-S和H-G样本的数据都进行 了采集（图7），所

10、有的数据处理工作在采集完成后进行。图7.全扫描色谱图比较。通过PLC-S皿apf G2获取的S和G细胞萃取物的数据。图8.目标化合物的鉴定和定量结果首先，自动筛选细胞萃取物中是否存在目标化合物。离子的鉴定和确认通过一个单一处理步骤使用 PositveTM软件包得出母离子和子离子的准确质量（2mDa窗口）而实现（图8）。该数据表明与Xevo TQ分析结果具有良好的一致性。图8给出了一个示例，化合物L-脯氨酸在细胞萃取 物中被明确鉴别出来，并在4个数量级中表现出线性的动态范围响应，RMS质量误差为0.57mDa。结论使用新型BEH Amide酰胺柱可开发出一种用于分离极性组织细胞代谢物的HILIC LC-MS方法，总运行时 间不到15分钟。同时采用Xevo TQ和Synapt G2 HDMS对红色和白色的肌肉组织莘取物进行定量分析，可明显区分出其主 要代谢物（比如AMP、A