生化课件第三章蛋白质5周3节

1、本章主要内容蛋白质概述 氨基酸 (重点)多肽（重点）蛋白质的结构（重点）蛋白质结构与功能（重点）蛋白质的性质（重点）蛋白质的分离纯化与鉴定（重点）七、Protein PurificationSalting outIon exchange chromatographyIsoelectric focusingGel filtration chromatographySDSUltracentrifugationDialysis and ultrafiltrationAffinity chromatography原理：电荷差异，参看amino acidsAnion (阴离子) exchangers D

2、EAE: diethylaminoethylCation (阳离子) exchangers CM: carboxymethylMatrix: 基质 cellulose- and agarose-based resins (树脂)2. Ion exchange chromatographyIon exchange chromatography等电聚焦（IEF）原理：电荷不同。可用于蛋白质等电点的测定，分辨率高。（pI 60000 rpm应用：纯化、分子量测定。最常用方法：密度梯度离心。 (density gradient centrifugation)超速离心原理：蛋白质颗粒的沉降取决于分子的质

3、量和密度。质量和密度大的颗粒比小的颗粒沉降的快，当颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，就停止不前。常用的密度梯度：蔗糖梯度、聚蔗糖梯度等。6. UltracentrifugationDensity Gradient Centrifugation （密度梯度离心）透析和超滤原理：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质。半透膜：玻璃纸、火棉纸、改性纤维素。应用： 将蛋白质与其他小分子物质分开 浓缩和脱盐 粗分离 7. Dialysis and ultrafiltrationDialysis (透析)Ultrafiltration (超过滤)Principle: Many proteins can

4、 bind specific molecules (ligand) tightly.Ligand is covalently attached to an inert matrix.A significant purification method.Immunoaffinity chromatography (免疫亲和色谱) ligand = antibody8. Affinity chromatography （亲和色谱）His-tag（组氨酸标签）为5-15 His 串在一起的小肽（His6最为常用）。一种亲和性tag，通过固定金属离子的亲和色谱（IMAC），用于表达纯化。其他用途： -

5、增加蛋白可溶性。 - 提高蛋白稳定性。蛋白质分离纯化全过程动(植)物组织浆状物蛋白混合物蛋白粗溶液蛋白沉淀蛋白液纯稀蛋白液蛋白沉淀蛋白液纯蛋白液80下保存机械破碎细胞破碎低速离心分级盐析高速离心溶解(buffer)电泳检查层析提纯盐析浓缩高/超速离心溶解(buffer)透析电泳检查（除盐）(除膜等杂质)蛋白质含量、纯度、分子量测定蛋白质含量测定 （1）凯氏定氮法 （2）双缩脲法 （3）Folin酚试剂法（Lowry法） （4）Bradford法（考马斯亮蓝结合法） （5）紫外吸收法 （6）胶体金测定法蛋白质纯度测定 （1）电泳法：常用。纯蛋白在不同pH条件下电 泳时，均得到一条区带（或峰） （2）沉降法：纯蛋白在离心场中，以单一的沉 降速度移动 （3）HPLC：常用。纯蛋白在洗脱图谱中呈现单 一的对称峰。 （4）恒浓度法：纯蛋白在一定的溶剂系统中具 有恒定的溶解度。 （5）N-末端分析法：适用于单链蛋白质。N-端 只有一种氨基酸。蛋白质分子量测定 （1）SDS 蛋白质在凝胶上的迁移速度取决于 蛋白质的分子量 Marker 分子量标准曲线 （2）凝胶过滤法 不同分子量的蛋白质分子在凝胶过 滤中的洗脱体积不同 FPLC （3）质谱法：准确、快速、需样量少。本章学习要点会画20种基本氨基酸及寡肽的结构掌握氨基酸及肽的性质，特别是带电性质和各氨基酸侧链性质掌