庆大霉素耳中毒后不同时间耳蜗血管纹HSP70表达与ABR的关系

1、庆大霉素耳中毒后不同时间耳蜗血管纹HSP70表达与ABR的关系【摘要】观察庆大霉素G耳中毒后不同时间豚鼠耳蜗血管纹热休克蛋白70HSP70表达与ABR的关系。方法：选用安康白色红目豚鼠100只，体重200250g，随机分为：生理盐水组、G组，各组皆连续用药10d。各组动物混合饲养，每日测量体重调整药量。在用药前和停药后1、3、7、14、30d分别检测ABR阈值，停药处死后应用SAB免疫组化技术，观察G中毒后不同时间豚鼠耳蜗血管纹HSP70表达情况。结果：G组停药3d时耳蜗血管纹HSP70阳性反响产物表达最多，ABR阈值最高。以后随着停药时间延长，染色逐渐变浅，ABR阈值逐渐降低，停药30d时染

2、色接近正常，但ABR阈值仍明显高于正常，它们与正常对照组相比差异均有显著意义P0.01。结论：耳蜗血管纹HSP70阳性反响产物灰度值与ABR之间呈线性关系，可以作为细胞受到应激刺激后细胞恢复程度的一个指标。【关键词】耳毒性庆大霉素热休克蛋白耳蜗免疫组化drugtxity;gentaiins;heatshkprtein;striavasularis;iunhistheistry庆大霉素gentaiin，G耳中毒后可以诱发耳蜗热休克反响,增加热休克蛋白heatshkprtein,HSP70在豚鼠耳蜗的表达,且ABR阈值变化与HSP70表达的变化高度负相关，HSP70具有保护听力的作用1。用扫描电镜

3、sanningeletrnirspy，SE的方法结合听脑干反响auditrybrainsterespnse，ABR阈值的检测已经证明：G耳中毒后豚鼠耳蜗毛细胞损伤后存活30d者其耳蜗毛细胞形态上有所恢复，且ABR阈值也有一定程度的恢复，G耳中毒后豚鼠耳蜗毛细胞具有再生修复才能2。那么，HSP70在G耳中毒后不同时间是否也表达并具有保护听力的作用呢？HSP70的表达与ABR的关系如何呢？目前尚不清楚。本实验应用SAB免疫组化技术及图像分析技术并结合ABR测试，观察G耳中毒不同时间豚鼠耳蜗HSP70表达及HSP70表达与ABR的关系，进一步讨论HSP70表达与G耳中毒毛细胞再生修复的关系及作用机制

4、。1材料与方法1.3耳蜗冰冻切片的制备各组豚鼠在行第二次ABR检测后，将豚鼠快速断头，迅速取出听泡。翻开听泡后，充分暴露耳蜗，在解剖显微镜下刺破圆窗膜，将镫骨底脱位暴露卵圆窗，在蜗顶钻一小孔，用微量注射器缓慢注入含40g/L多聚甲醛的磷酸缓冲液，再将标本置于上述固定液中4下2h。磷酸盐缓冲液(phsphatebufferedslutin,PBS)冲洗后，放入100g/LEDTA中4下脱钙57d，再移入250g/L蔗糖磷酸缓冲液中，4过夜。次日用T包埋，行20恒冷冰冻切片。1.4免疫组织化学方法检测HSP70HSP70免疫组织化学方法检测试剂盒由武汉博士德生物工程提供。切片枯燥后，用蒸馏水洗3次

5、。将切片放入用甲醇稀释的5g/LH22中室温下浸泡30in，以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3次。滴加抗原修复液，室温10in，蒸馏水洗3次。滴加正常血清封闭液，室温下孵育20in，甩去多余的液体，然后滴加稀释度为1：150的一抗，4过夜。用0.01l/L的PBSpH=7.4洗3次。滴加二抗，室温孵育20in，用0.01l/L的PBS洗3次。滴加SAB溶液，室温孵育20in，0.01l/L的PBS漂洗4次，DAB显色，脱水，透明，封片。显微镜下观察。阴性对照组，用0.01l/L的PBS代替一抗，其他程序不变。1.5显微图像分析处理采用etarph/lsnapfx/AX70显微图像分析系统美国、

6、日本结合消费，每组随机抽取20张切片，将载玻片置于显微镜1040下，呈现图像后，用数码照相机拍照后，将图像输入计算机，在同等条件下测量各组每张切片血管纹细胞HSP70阳性反响产物灰度值，分别计算各组血管纹细胞HSP70阳性反响产物平均灰度值。1.6统计分析将实验数据进展处理，数据以均值标准差xs表示，显著性检验采用t检验及相关分析。2结果2.1ABR阈值检测各组ABR结果如表1所示。各组用药前ABR阈值差异无显著意义P0.05。停药1d后，G组的ABR阈值明显高于正常对照组P0.01；停药3d时，G组的ABR阈值最高，以后随着停药时间延长ABR阈值逐渐降低，但仍明显高于正常对照组P0.01。表

7、1各组豚鼠用药前后的ABR阈值注：与用药前比拟：1P0.01；与正常对照组比拟：2P0.012.2HSP70免疫组织化学方法检测结果反响产物呈棕黄色颗粒。正常对照组细胞：各时间组豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反响产物均呈弱阳性；G组的豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反响产物明显强于正常对照组，随着时间延长染色逐渐减弱，停药30d时染色接近于正常如图13所示。反响的平均灰度值结果如表2所示。G组中停药后不同时间豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反响产物的平均灰度值均较正常对照组明显减少P0.01，即G能显著增强耳蜗HSP70的表达。在各时间组豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反响的平均灰度值,停药3d组其HSP7

8、0阳性反响的平均灰度值最低。停药30d时染色接近于正常，较正常对照组相比差异无显著意义P0.01。表2各组豚鼠耳蜗各部分HSP70阳性反响的平均灰度值比拟：与正常对照组比拟：1P0.001；2P0.012.3豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反响的平均灰度值与ABR阈值的关系停药后不同时间，随着各组豚鼠耳蜗HSP70阳性反响的平均灰度值的变化，ABR阈值也发生相应的变化，耳蜗血管纹HSP70阳性反响的平均灰度值越高，ABR阈值越低，它们之间呈负相关表3。即HSP70表达越少，ABR阈值越低。表3豚鼠耳蜗各部位HSP70阳性反响平均灰度值与ABR阈值的相关分析注：相关系数的假设检验：1P0.0013讨

9、论实验结果说明，在各时间组豚鼠耳蜗ABR阈值检测中，停药3d时，G组的ABR阈值最高；在各时间组豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反响的平均灰度值,停药3d组其阳性反响的平均灰度值最低。这意味着G耳中毒后，以停药3d组受损最重，且HSP70的表达和生理功能具有一致的表现。HSP70的细胞保护作用是指在受到各种应激刺激时，产生HSP70可以增强细胞对损害的耐受程度，维持细胞的正常功能代谢，进步细胞生存率3。在应激状态下，HSP70的表达及细胞保护作用与细胞的生理状态有关。Gutsann等证明，随着机体衰老和细胞老化，HSP70和HSP70RNA的功能和合成均有所降低，因此HSP表达的改变不仅可能是机体衰老和细胞老化的一个重要因素，而且还可以作为判断细胞生理状态和应激才能的一个标准4。实验结果说明，在G耳中毒后HSP70表达增强，说明G耳中毒耳蜗细胞生理功能状态良好。实验结果还证明，随着G耳中毒后停药时间的延长，各组豚鼠耳蜗ABR阈值降低，且各组豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反响产物减少、灰度值增加，HSP70阳性反响产物灰度值与ABR之间呈负相关。我们前期工作已经证明在停药30d时，G耳中毒耳蜗毛细胞在形态和功能上均可有一定程度的恢复。因此我们认为，HSP还可以作为细胞受到应激刺激后细胞恢复程度的一个指标。目前，大多数学者认为HSP在应