T-载体连接方案

1、T-载体连接全过程第一步：PCR扩增目的基因及纯化PCR反应体系：10 x扩增缓冲液5.0ulTOC o 1-5 h z10mMdNTP1.0ul引物11.0ul引物21.0ul模板DNA1.0ulTaqDNA聚合1.0ul加双蒸水至50ul（相同的引物体系可配置PCRMIX体系）PCR反应条件：PCR反应条件为温度、时间和循环次数。955min95-、45s4060；50s循环35次72-55s72-10minPCR期间配置琼脂糖凝胶：PCR结束以后跑胶验证，并照相，标记保存。PCR产物回收（1）单一PCR产物用氯仿法把PCR产物转移至1.5ml的离心管，加500ul无菌水，500ul氯仿异

2、戊醇（24:1），混匀后10000rpm离心5-10分钟转移上清（约400ul）至灭菌的新1.5mL的Eppendorf管，加入2倍体积（780叱体积即可）的无水乙醇与40ul3MNaAc。置冰上或-80冰箱30分钟以上。10000rpm离心10min。弃上清，沉淀用适量的70%的乙醇洗一次，于纸上扣干。小心不要将沉淀洗掉。置于恒温器上干燥（55）至无色透明或无乙醇气味，大至要510min。加入40叱无菌水溶解沉淀备用。（2）多条带PCR产物用切胶回收试剂盒。PCR产物进行琼脂糖电泳（大容量上样系统）切胶并回收目的条带至1.5ml的离心管，称重。参照试剂盒说明书进行操作（附录3）。用50ul无

3、菌水洗脱离心柱2次备用。第二步：T-载体连接和转化准备工作：制备感受态细胞，方法见附录一，LB培养基，Amp母液，氯化钙的配制，方法见附录二；.在微量离心管（PCR管）中配制以下体系：注：T-载体试剂盒开封前要向pMD18-TVector管中加入25ul无菌水，同时再管上面做标记。pMD18-TVector1.0ul外源DNA1.5ulSolutionI2.5ul.16或4低温连接1h-2h（最好过夜）；.连接产物全量加入50ul的DH5a感受态细胞中，轻轻摇匀后冰上放置30min；DH5a感受态细胞加5ul0.1M的无菌氯化钙做阴性对照；.热击：42水浴中热击90秒（注：精确计算时间，过长将

4、对细胞造成伤害）,热击后立即置于冰上冷2-5分钟（禁止摇动）。.复苏：向每管中加入预冷的400ulSOC液体培养基（注：不含Amp）,混匀后37轻摇培养11.5小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因（Ampr）。.涂布平板筛选转化质粒：将上述各管培养液摇匀后取50ul分别涂布于含Amp的筛选LB平板上。（注：1.将培养液摇匀后涂布，并要把平板涂干。）正面向上放置15分钟,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37培养过夜。.次日（12-14小时后）观察和从平板上挑取单克隆于甘油lb中（10-20%甘油），每个平板挑3个单克隆，-20保存。第三步：裂碱法提质粒.取40AL的甘

5、油菌接种至于含有0.6mL含有Amp的LB的1.5mLEppendorf管，37震荡培养过夜；.次日将培养的菌液10000卬山离心3山皿，弃上清。3、加入100AL溶液I振荡使菌体沉淀充分悬浮，务必悬浮充分。4、加入200瓦溶液H,立即轻轻翻转几下，使菌体裂解。可观察到原浑浊的菌悬浮液变清变粘，放置时间不能超过6min。5、加入150瓦预冷的溶液田，立即上下颠倒充分混匀7-10次，不宜太剧烈。可观察到白色片状沉淀出现。6、置冰浴10min,也可置于一20中5min。7、10000rpm离心810min。8、在离心过程中可取未灭菌的新1.5mL的Eppendorf管，加入等体积（350400AL

6、即可）酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）备用，取灭菌的新1.5mL的Eppendorf管，加入2倍体积（780AL体积即可）的无水乙醇与40ul3MNaAc备用。9、离心完将上清迅速倒入已加的酚-氯仿-异戊醇中，充分混匀。小心不要将白色沉淀物倒入酚-氯仿-异戊醇中。10、10000rpm离心10min。11、吸水相，加入已加好的无水乙醇中，颠倒混匀几次（小心不要吸入酚相，没把握时宁可放弃一些水相）。置冰上或-80冰箱30分钟以上。12、10000rpm离心10min。13、迅速弃上清，沉淀用适量的70%的乙醇洗一次，于纸上扣干。小心不要将沉淀洗掉。14、置于恒温器上干燥（55）至无色透明或无乙

7、醇气味，大至要510min。15、加入40ALTE溶解沉淀，琼脂糖电泳检测。16.20储存备用。第四步：PCR验证PCR反应体系：10 x扩增缓冲液1.0ul10mMdNTP0.2ulTOC o 1-5 h z通用引物10.2ul通用引物20.2ul模板DNA0.2ulTaqDNA聚合0.2ul加双蒸水至10ul（最好配置PCRMix）PCR反应条件：PCR反应条件为温度、时间和循环次数。955min95-、45s55a50s循环35次72_.：55s7210minPCR期间配置琼脂糖凝胶，PCR结束后跑胶验证;记录实验结果。注：感受态制备和试剂配制见附录附录一感受态细胞的制备（CaCl2法）

8、第一天1、挑DH5a或忖109单克隆菌落至3ml无抗生素的LB中，37摇床培养过夜2、检查准备无菌的试剂：0.1MCaCl（应提前预冷）、含10%甘油的0.1MCaCl、无抗生素的LB（500山1三角瓶放置250mlLB）3、检查准备无菌的试剂：1.5山1离心管（每250ml培养体系准备2罐约300个）、50ml离心管（6-12个）、200ul与1ml枪尖（各1盒）。第二天1、1:20-50扩大培养至250ml培养体系至OD600为0.6-0.8（约3小时）2、将菌液移入冰水物后开超净台紫外离心机预冷，30分钟后分装至0ml离心管中，然后于4下50001离心5分钟；3、弃去上清（轻轻倾倒掉上清

9、液）；加5?J0m预冷的1mol/I的CaCl溶液，轻轻拨动管底使细胞完全悬浮冰上放置15分钟后,4下5000rpm离心5分钟（合并至2管）4、弃去上清（轻轻倾倒掉上清液）；加入.0山1预冷的1mol/L的CaCl2溶液，轻轻拨动管底使细胞完全悬浮，4下5000卬山离心5分钟；5、弃去上清，加入15ml预冷含10%甘油的0.1MCaCl，轻轻悬浮细胞，将感受态细胞悬液分装成若干份，每份0口l（注意悬液密度要均匀）。6、用液氮速冻，将感受态细胞置于-80保存。注：CaCl2处理后的细胞比较脆弱，尽量温柔操作!全过程要再冰上操作，及无菌操作！附录二1.培养基或试剂的配制：（1）LB培养液配方：（单

10、位g/L）胰蛋白胨10酵母提取物5NaCl10按配方称量药品,加入一定量的ddH2O后，待完全熔解后加入ddH2O定容至1000ml,用NaOH调节pH至7.0。分装至500ml三角瓶（250山1每瓶）或500ml盐水瓶（500ml每瓶）；121湿热高压灭菌20-30分钟待用。（2）AmpLB培养平皿配方：（单位g/L）胰蛋白胨10酵母提取物5NaCl10按配方称量药品,加入一定量的ddH2O后，待完全熔解后加入ddH2O定容至1000ml,用NaOH调节pH至7.0。分装后若为固体，另加琼脂（1.5%）15g（注：LB培养液不加琼脂）；121湿热高压灭菌20-30分钟，待冷却至60左右,在超

11、静工作台中加入一定量的Amp储存液使终浓度为100口g/ml,摇匀后用培养皿铺板（90山山平皿约铺10ml）。2、Amp母液：称取氨苄青霉素50mg溶于1mlddHO中，用0.22Hm微孔滤器过滤除菌，储存于2-20冰箱.3、0.1mol/LCaCl2溶液:称0.56gCaCl2无水分析纯），溶于50ml重蒸水中，定容至100ml,用0.22口m滤器过滤除菌or高压灭菌。4、含甘油的0.1mol/LCaCl2溶液：称0.56gCaCl2（无水分析纯），溶于50ml重蒸水中，力口15ml80%的甘油，定容至100ml,用0.22口m滤器过滤除菌or高压灭菌。附录三1）在紫外灯下切分含人的琼脂糖块，尽可能除去多余的琼脂糖.放入1.5山1离心管中。2）按每100mg琼脂糖加入300600口1溶胶液的比例加入溶胶液（本实验加500过），置55水浴10分钟，使琼脂糖块完全溶化，期间每2分钟颠例混匀一次促溶。3）将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，12000rpm室温离心1分钟，倒掉收集管中的液体再将吸附柱放入同一个收集管中。4）在吸附杜中加入500”漂洗液，室温静置1分钟后，12000rpm室温离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。5）再在吸附柱中加入