人淋巴细胞姐妹染色体区分染色实验原理及步骤_第1页
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1、 实验七 人淋巴细胞姐妹染色体区分染色 一、试验原理： 姐妹染色体在正常情况下化学组成及结构都是一致的，因此不能用单纯染色方法将之区别开来。 1973年Latt发现让细胞在含Brdu的培养基中培养了2个细胞周期，再以Hoechst33258染色后，两条姐妹染色单体就出现了色差，这就是姐妹染色但提到区分染色（Sister Chromatid Diffeientiation SCD）。 当细胞在含Brdu的培养基中复制DNA时，Brdu会当作胸苷的类似物而掺入到DNA分子中，经过一个复制期，两条染色单体的DNA分子中都有一条是含Brdu的新链和不含Brdu的老链，称为BT-染色单体，BT-染色单体

2、再进行一次复制，形成两条DNA分子。其中一条DNA分子仍属于BT-型，另外一条则是两条单链都含有Brdu，到中期时为BB-染色单体，如图所示： Hoechst 33258 在对这种染色单体染色时，就发生着色程度的差别。BB-型和BT-型染色单体被Giemsa染色时，仍然没有光差。因此，先用紫外线照射，使Brdu光解，然后以Giemsa染色时，则有色差出现，BB-型染色单体染色浅，BT-型染色单体色深。SCD可应用于许多方面，如研究DNA的半保留复制，细胞增殖动力学，染色单体互换（SCE），SCE目前很广泛地应用于环境诱变剂的研究。二、Brdu溶液的配制：1.Brdu溶液： Brdu 5mg 无

3、菌生理盐水 10ml 溶液装入无菌青霉素瓶，黑色纸避光，置于4oC冰箱保存。2.培养液：PHA，青链霉素的配制与微量全血培养试验相同。3.0.05%秋水仙素溶液： 秋水仙素 5ml 生理盐水 10ml4. 2SSC 溶液: NaCl 17.4g 枸缘酸钠 8.84g 双蒸水 1000ml5.磷酸缓冲液：（pH6.8）6.3%Giemsa染液（以上述缓冲液配制）三、器材： 恒温箱（37oC） 水浴锅（45-50oC） 紫外线灯（20或30W） 铝饭盒 擦镜纸 铁丝架 吸管、镊子 染片玻璃架四、操作方法： 1.细胞培养与外周血培养试验相同，在加入Brdu后，其最终浓度为10/mg并注意避光培养。 2.用常规方法制备染色体方法。 3.在染色体上（不受片龄限制）滴加较多2SSC 溶液，并覆盖上一层擦镜纸，放置在含有2SSC 溶液的饭盒内，使溶液恰好浸至玻片表面，放置在水浴锅上的铝板上，使饭盒内溶液温度为4550oC。 4.用30W或20W紫外线灯，距标本46cm处照射30分钟左右，使标本表面始终保持润湿。 5.用蒸馏水冲去擦镜纸。 6.用3%Giemsa染液染色410分钟，（如果染色较浅，

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