碱性磷酸酶显色剂使用方法

1、5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate (5-漠-4-氯-3引哚基-磷酸盐)，BCIP/NBT (四唑硝基 蓝)是碱性磷酸酶底物，产物为深蓝色，在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP被水解，水解产物 与NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。使用方法在膜或组织切片，最后一次洗涤完毕后，加入适量BCIP/NBT染色工作液室温避光孵育5-30分钟或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深度.用蒸馏水洗涤1-2次即可终止显色反应膜标本可干燥后避光保存；组织切片或细胞样品，显色反应终止后，可以用中性红复染 染色干细胞成骨诱导的常用染色方法有

2、几种碱性磷酸酶(ALP)是成熟成骨细胞的标志性酶，同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞 的标记物。成骨细胞染色方法 以ALP为目标物的检测方法：1 Gomori钙钻法【染色原理】ALP在pH值9.4的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把8 -甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸 与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钻作用形成磷酸钻，经硫化胺处理形成黑 色的硫化钻沉淀在酶活性处。【孵育液配制】3%8 -甘油磷酸钠5ml2%巴比妥钠5ml蒸馏水10ml2% CaCl2 10ml2% MgSO4 1ml【步骤】将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，呆细胞长满 玻片后取出。PBS

3、冲洗后用冷丙醇固定10min，蒸馏水冲洗数次。入孵育液中，37C孵育4-6h。自来水冲洗数次。2%硝酸钻中浸3-5min，蒸馏水洗数次。1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。2偶氮偶联法：【孵育液配制】萘酚AS-BI磷酸盐20mgDMSO 0.5ml0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液(PH 9.2) 50ml六偶氮副品红0.5ml1mol/L NaOH调PH 9-10，混合后过滤使用。(六偶氮副品红：副品红400mg，浓盐酸2ml，双蒸水8ml混合过滤；临用前与等体积4% 亚硝酸钠混合)【步骤】干细胞爬片成功后，PBS冲洗后，置入4C

4、10%甲醛固定10min。蒸馏水冲洗。将过滤孵液直接滴加于玻片上，室温下作用45min。流水冲洗，晾干。甘油明胶封固。【结果】成骨细胞胞质中可见红色ALP阳性颗粒。3碱性磷酸酶染色试剂盒法：【作用原理】干细胞内碱性磷酸酶在Ph9.4-9.6条件下水解磷酸萘酚AS-MX产生萘酚，后 者被重氮盐捕获，生成不溶性有色沉淀。【作用液配制】取2号储备液10ml，加3号液200ul，再加4号粉剂10mg，振摇速溶，立即过滤到细胞爬 片上。【步骤】细胞爬片滴加数滴1号液，室温固定一分钟(不可以延长)，流水漂洗2分，晾干。滴加作用液数滴，置湿盒内于37C孵育2小时，流水冲洗2分钟。滴加5号液数滴，复染5分钟，

5、流水冲洗2分钟，晾干。【结果】阳性结果是胞浆内出现蓝色沉淀。针对钙沉积物“钙结节”的染色方法：4茜素红法【作用原理】利用沉积的钙于茜素红发生显色反应，得到红色的染色效果。【步骤】培养皿用PBS冲洗2次，95%乙醇固定10min，双蒸水冲洗3次。0.1%茜素红-Tris-Hcl (PH 8.3) 37C，30min。蒸馏水冲洗，干燥，封片。【结果】染料品种的不同，矿化结节呈现不同的红色。5 von Kossa 法【作用原理】Von Kossa s矿化结节染色法原理是将矿化基质中的磷酸盐(钙)、碳酸盐(钙)转变为磷酸银、 碳酸银，然后用日光、紫外线或强还原剂使其还原为黑色的金属银。本试验染色过程中

6、未作 细胞衬染。【步骤】培养皿用PBS冲洗2次，4%多聚甲醛固定5分钟，双蒸水冲洗3次。培养皿中加入5%硝酸银溶液1ml，将培养板开盖在紫外灯下照射1小时。倒出残留的硝酸银溶液，蒸馏水冲洗3遍。培养皿中加入5%硫代硫酸钠溶液1ml，中和残留的硝酸银溶液，吸出残液。（5）室温下晾干，封固0.1%茜素红一Tris-Hcl（PH 8.3）溶液配方具体配制方法：1g Tris （1g左右Tris均可）加入三蒸水100ml中用滴管往配制液中加HCl （分析醇），一滴滴地加，边加边测试PH待PH为8.3左右即可（无精密PH测试仪，用PH试纸也是一样的，但是要能测到8点几 的PH试纸）配好后往里面加0.1g

7、的茜素红于是0.1%茜素红一Tris-Hcl（PH 8.3）溶液就配好了。茜素红S中文名称： 茜素红 S 英文名称:alizarin red S; sodium alizarin sulfonateCAS: 130-22-3 分子式：C14H7NaO7H2O 分子量：360.28 中文别名：9,10-二氢-3,4-二羟基 -9,10-二氧代-2-蒽磺酸单钠盐；茜素红；（3）茜素磺酸钠；茜素S ；酸性媒介茜素红； 酸性媒介红 S-80 （Acid Mordnat Reds-80）； C. I.媒介红 3 （C. I. Mordant Red 3）。性质：橙黄色的针状体。溶于水，微溶于醇，不溶于氯仿和苯。1%水溶液pH2.15。由茜素 经发烟硫酸磺化，然后转变为钠盐制得。茜素红能和许多金属离子生成稳定的红色络色物， 在分析中常用作金属指示剂；光度法测定金属离子的显色剂；在分析中常用作金属指示剂; 光度法测定金属离子的显色剂；酸碱指示剂，第一变色范围PH值3.7（黄）5.2（紫），第二变 色范围PH值10.1（紫）12.0（浅黄）；用于极谱法测定金属离子。用途：络合滴定指示剂和酸碱指示剂。配制：将托盘天平上称取0.1g茜素磺酸钠定溶于100ml蒸馏水中