分离菌的各种培养基

1、人造海水的配方*(引自 Chemical Oceanography ,Second Edition , Millero F J,1996 ) *：水化合物的总重量为 1kg.名称质量(X10-3cg)氯化钠23.98氯化镁5.029硫酸钠4.01氯化钙1.14氯化钾0.699重碳酸钠0.172溴化钾0.100硼酸0.0254氯化锶0.0143氟化钠0.0029?fi water； ASWh 人工悔的组戒(Lymnn and Fleming, 1940)如下&MaCl24.477(?M 电 30*3.9170fiCflCli-HjOf.1020bKC10.6640fi0.!920gKBr0血勉S

2、i120024(NaFmoo娅離tB水1 OOOnil为了避免沉淀的产生.人工海感的各成分需聲分别溶解，然后再混合F pH$7.5,可以用浓的氢氟化钠或盐酸来调节p用以上人工梅水代替天然悔水大大方便了实验室条件下对真菌的培养.使海海洋微生物及其代谢产物 -林永成主编 2003 细菌的分离： 牛肉膏蛋白胨琼脂、营养琼脂等是分离细菌的常用培养基，前苏联细菌学家设计的 ZOBELL 2216E培养基是培养好气性异养细菌较好的培养基，可培养多种细菌，SIMIDU培养基也常 用于海洋好气性异养细菌的分离， PFENNIGS 培养基适用于海洋光合细菌的分离，分离海洋 弧菌可采用TCBS培养基，培养基PH

3、一般为72-7 6,盐度为28到30,培养温度28到37, 培养时间 1 到 7 天，注意观察平板菌落变化， 1 到 2 天先挑取大菌落， 5到 7 天后再挑取小 菌落，为防止真菌的污染，常在培养基中添加一定的抗真菌抗生素，如制霉菌素、两性霉素、 放线菌酮等。放线菌因生长缓慢且菌落不大，一般不会对细菌的分离产生影响。放线菌的分离：放线菌是数量最多、最常分离到的 G+， JENSEN 的研究表明，离海岸越近，在 0 到 1 米水 深的底泥样本中，链霉菌占分离的放线菌总数的 86%，小单孢菌占 12%，其他占 2%。分离培养基多采用合成培养基（高氏合成一号、精氨酸、天门冬素培养基）和有机培养基（H

4、V、YE、WAKSMAN、 bennett）, 高氏合成一号是分离的常用培养基，适合尤其是链霉菌的生长，但细菌和真菌也 大量生长。HV是以腐植酸为唯一碳、氮源的培养基，对小单抱菌、小双抱菌、指抱囊菌、 链孢囊菌的选择性高，但是生长的放线菌形态不完整，难以观察，给挑菌工作带来困难。抑制剂放线菌酮、制霉菌素可抑制真菌，青霉素、链霉素可抑制细菌，重铬酸钾对真菌和细菌均可 抑制，0005%-001%是较理想的分离抑制剂，有三个特点：抑制细菌和真菌的生长，不影 响放线菌的正常生长，还可促进一些放线菌孢子的萌发，价格低廉。样品预处理120 干热处理样品 1 小时能大大减少细菌和链霉菌的数量，而对稀有放线菌

5、影响较少，甚至能利于孢子萌发，由于海洋样品多潮湿，同时孢子对湿热敏感，故采用50到55度的热处理 会促使大部分孢子萌发。化学杀菌剂法杀菌剂苯酚SDS葡萄糖酸洗必泰CG苄索氯氨BC碳酸钙氯化钙富集的放线菌非链霉菌属小单抱菌智囊抱菌小双抱菌非链霉菌属小四抱菌所有放线菌放线双抱菌小四抱菌链抱囊菌差速离心 浓缩真菌的分离：到2000年止已认知的海洋真菌仅仅444种，包括177属360种的子囊菌（占811%）, 51 属74种半知菌（占167%）和7属10种的担子菌（占22%）选择性富集海水样品可通过浓缩或过滤，用无菌的045Mm孔径的硝酸纤维素滤膜过滤海水，然后直接 把滤膜放在培养基上培养。分离酵母菌

6、时，可将含50-200 mg/L氯霉素的分离培养基用浓盐酸调PH值至34酸性条 件下可抑制很多细菌生长。植物内生真菌分离方法： 进行分离前，对植物材料表面进行彻底消毒非常必要，典型的消毒剂有70%-90%的乙醇、漂 白剂、1%的过氧乙酸和3%-30%的过氧化氢，多采用PDA培养基，并加入庆大霉素、氯霉素、 链霉素等抗生素，抑制细菌和放线菌的生长。鉴定：16S rRNA 相对分子量适中，易于进行序列测定和分析比较，可以为细菌鉴定提供相对稳定 可靠的信息，广泛用于评价生物遗传多态性和系统发生关系。18S rRNA成为目前研究真菌 属物种多样性的分析比较。原核微生物rRNA包含23S、16S、5S，

7、真核微生物转录区包含5S、 18S、 5 8S、 28S。（C+G）mol%在种内不超过4%,属内不超过10%。低于2%没有分内学意义。只具有否定价值， 需与表型特征相结合。16S rDNA成为细菌种属鉴定和分类的标准方法，适用种及种以上的分类单位。同源性三95%的菌可归为同一属，三97%可视为同一种，大于97%时必须测定DNA-DNA杂交率 是否大于 70%才能确定是否为新种。由于对同种内的不同菌株分辨力较差，更适合研究属及 属以上的菌株。18S rDNA 普遍用于真菌物种的鉴定分析。植物内生真菌的分离 叶、叶脉、茎、树皮（韧皮部）等样品用自来水冲洗掉泥土，然后进行 严格的表面消毒程序：依次

8、浸泡在75%酒精lmin, 3%一5%有效氯的次氯酸钠溶液3 min。75%的酒精0. 5min，然后再用无菌水冲洗3遍。晾干后，在超静台将其剪成约0. 5 cmX0. 5 cm左右小片。将处理好后剪成的小片铺于PDA平板上，加入氯霉素与链霉素各50斗g/mL抑制 细菌的生长，在26C培养培养23周分离内生真菌。这些平板在第1周要每天检查1次，然后 可以3、4d检查1次。一旦发现有菌丝从组织小块长出，应马上将其转接到另一新的平板上， 经几次纯化保存于PDA斜面。植物组织样品处理: 将采集的红树林植物样品先用流动的清水冲洗干净,再超声清洗彻底去 除植物组织表面的杂质, 把植物样品剪切成15 cm

9、 左右长度的节段进行表面消毒。样品依次 用次氯酸钠（含5%有效氯量）浸泡5 min,无菌水清洗3次，75%酒精浸泡3 min,无菌水清洗3 次，晾干，用粉碎机把植物组织粉碎备1.3, 1各种样詰预处理方袪样品悬浮液的直接制备;称取2 g样品海生动植物休用无菌剪刀剪碎）到20 nd的无菌海水中，旋涡掘荡10就几 使其充分混悬SDS法处理样品恂刚称取2呂样品海生动植物体用无菌剪ZJ剪碎）到20 mL含有0. 05 % SDS和 %酵母膏的无菌海水中，振荡3-5min后，豹200 rmi下振荡30 min.苯酚法駁理样品闿:称取2官样品（海生动植物体用无茵剪刀剪碎）到含有1. 5 %苯酚的20机 的

10、无菌海水中+振荡3-5 min后，30YJ. 200 rmin1下 振荡30 mi恥加热法处理样品陽门h将直接制备好的样品悬浮液55C水浴6 min.（或aorr i h）注竜：样品处理的輕个过程必须是无菌的表1-1菌种分隔师逸所用到的培养基名称配方%酵母粉-圭牙膏琼脂(YE1 1121酵母粉0 4麦芽臂1,葡苗轉0.4,琼脂出陈海 水咫 蒸谓水25, pH； L 2-7.4魂粉-干酩素琼脂(SC) m可涪性淀粉L 卡酪索0.03. KMOi 0.2%, NaClOh 2,矗弧 0.2,血沖 弧。O.CMJ5r CaCOi0.002h PeSO. 0.001p 琼脂 2,放线菌酣 75piw

11、陈75,煎惰水 25. pH: 7. 2-7.4伺萄糖-天门窑醴氨tW J,天门辔醜氧CL05,磷酸氢二钾0.05,琼脂CGA)仙小琼脂N陈海吒,蒸悝水跡，pH: 7.2-7. 4腐殖酸-维生素琼脂HV网腐殖酸 0, 1, 阪HPCk 0.005, KC1 0 17 .嗨56 7也0 0. 005. FeSOi * 711*0 6 001,CaCQ,0.GQ2 n硫胺素500 ppm,核黄索250 ppm,肌醇：?C;0 ppm,泛酸 5&0 ppm 对短基竝酸 5DO ppp ,憑物素500 ppm.维生黑BtSOO ppn,泛酸500阿，烟酸500 口呱 琼脂2,陈海水75.蒸憾*皈 pH

12、:7,2-7. 4淀粉蛋白豚琼脂(Ml)何可溶性淀粉0,25.雪白陈仃酵母0.05 廿油織酸一钠0.01,球脂站陈海忒閒蒸博水PH7, 2-7.4葡萄糖-蛋白陈(Martin) ,H葡萄糖L.CL资白關&乩MP0. L0tMSOJEW 0.05,琼脂 2,pH:7. 2-7A淀粉-苛豆粉液体发酚堵养建可溶性淀粉占 黄豆粉抽握物1.5,(SLM) 1,41醇毋粉0 5. CaCO, 0.4,陈海水75.蒸诩水2氐pM:7. 2-7.4O) HV的配制：称取腐植議.加 叹的1LCL,煮沸石过滤取上清：各种维生索导培养基其 他成分开灭葡，倒皿前DO入n以上培养基除GA要求115匸下.天菌30 mir

13、.外其余培养基询是1211C,灭菌21 mirio加入750 ppm放线菌酮的YE. SC. GA. HV用于涂布预捷理后的样品；加入100 卩阿重锯酸押的YE. Gause用于施格醴钾选择法，不加任何抑制剂或抗生素的YE、SC.GA. HV柞为对照.不加任何抑制剂或抗生素的E斜而用来保藏放线菌和真蔺2.22.1分离培养基2216E培养曜：Yeast extract1 gPeptoneAgar5g2%FePO4 陈海水配制0.1 g1000 mLISP3培养基：Oatmeal20 gTrace salt solution1 mLAgar2%蒸馆忒lOOOmLpH7.2Trace slt sol

14、ution：FeSO7H2O0.1 gMnCl2.4H2O01 gZnSO7H2O0.1 g去离子水100 mL察氏培养基；NaNO32gKjHPO*1KCl0-5 gMgSCh0.5 gFcSOj0.01 g朮糖30 EAgar2%蒸馆水1000 mLPH7*2GYM培养棊；Glucose4gYeast extractMalt extract10 gAgar2%蒸帽水1000 mLpH7.2儿丁质培养基：K2HPO405呂MgSOUHO02 gFeSO4-7H:O0.01 gGlucosef火菌后加入）10 g几丁质imAgar2%lOOOinLpH72HV培养基七腐植酸1 gNa:HPO4

15、OSgKC1FeSO7H2O10 mgMgSO4.7H2O20 gCaCh002 g核黄素0.5 mg肌哮0.5 mg对氨基苯甲酸0.5 mg生物素0.25 mg烟酸0.5 mg泛酸0.5 mg维生素B60,5 mg硫胺素0-5 mgAgar2%蒸ts水1000 mLpH7.2H纯化培养基高氏号培养基：可溶性淀粉20gKHPm0-5 gMgS04.7H2（）0.5 gNaCl0.5 gNaNO31.0 gF?SOj0.01 g琼脂2%蒸脩水1000 mLpH7.22.223发酵培养基TSB培养基（上海中科昆虫生物技术开发有限公司）:胰蛋白豚17.0大豆蛋白脏NaCl5.0 g25 gKH2PO

16、42.5 蒸ta水1000 mL消前 pH 7.0-72发酵塔养基可溶性淀粉20 黄豆讲粉葡萄糖5g酵毋提取物2.5 CaCCh5 gNaCI5g蒸憾水1000 mL州7t2M 2-4培养纵Table 2-4 Cultuie medium名称配方HL1培养基67.Og酵母氯源(Yeast Nitrogen Base. Difco)和ltWin吕酩蚩门水胖物(Casainino acid, Difco -酒IL Sf佛水中过滤陈I礼 卅1询该落 液巾加入无菌的斶酸氧二却辭液.| T- 2% ：.jI；： ： 121 U . 20iuin) | A IOOiuL I：述狂木冷菲基即叫.HL2 养基価肺抽1咋蚩白陈冶 脐蚩门腕圮 Nacl5g.琼脂羽g. lOOO