食品管理-食品检验技术之蛋白质和氨基酸的测定

1、食品检验技术之蛋白质和氨基酸的测定（一）测定方法概述1、测定蛋白质含量的方法：凯氏定氮法快速测定法（双缩版、紫外、水杨酸比色、染料结合法）2、测定氨基酸的方法：甲醛、电位滴定、苗三酮比色气相、液相、薄层、离子交换色谱 自动分析仪（二）凯氏定氮法1、实验原理以硫酸铜为催化剂，用浓硫酸消化试样，使有机氮分解为氨，与硫酸生 成硫酸镂。然后加碱蒸储使氨逸出，用硼酸溶液吸收，再用盐酸标准溶 液滴定。根据盐酸标准滴定溶液的消耗量计算蛋白质的含量。2、实验步骤（1）试样的制备与称样（称0.5-5g试样（含氮30-40mg）放入凯氏烧 瓶中）。（2）消化向凯氏烧瓶中依次加入硫酸铜0.4g、硫酸钾10g、硫酸2

2、0mL。将凯氏 烧瓶放在电炉上，缓慢加热。待起泡停止，内容物均匀后，升高温度， 保持液面微沸。当溶液呈蓝绿色透明时，继续加热0.5-lh。取下凯氏烧 瓶冷却至约4（TC,缓慢加人适量水，摇匀，冷却至室温。（3）蒸播与吸收将消化好并冷却至室温的消化溶液全部转移到100mL容量瓶中，用蒸 偏水定容至刻度，摇匀。向接收瓶内加入30mL2%硼酸溶液和1滴混合指示剂。将接收瓶置于蒸 储装置的冷凝管下口，使下口浸入硼酸溶液中。取100.05mL稀释定 容后的试液，沿小玻璃杯移入反响室。并用少量水冲洗小玻璃杯，一并 移入反响室。塞紧棒状玻璃塞，向小玻璃杯内加入约10mL40%氢氧化 钠溶液。提起玻璃塞，使氢

3、氧化钠溶液缓慢流入反响室。立即塞紧玻璃 塞，并在小玻璃杯中加水，使之密封。通入蒸汽，蒸储5min0降低接 收瓶的位置，使冷凝管管口离开液面，继续蒸播Imin。用少量蒸储水 冲洗冷凝管管口，洗液并入接收瓶内。取下接收瓶。（4）滴定用0.lmol/L盐酸标准滴定溶液滴定收集液至刚刚出现紫红色为终点。同一试样做两次平行实验，同时做空白实验。3、结果计算（VO/V） X0.014XCx（%）=XFX100mx（10/100）;（三）快速测定法为满足生产过程的快速控制分析，减少环境污染、简便操作省时，建立 了快速测定方法；如：双缩眼法、紫外分光光度法、水杨酸比色法、染料结合法。1、双缩眼法（1）原理：双

4、缩版在碱性条件下，能与硫酸铜结合生成红紫色络合 物。蛋白质中含有肽键，与双缩胭结构相似，也呈此反响。在一定条件 下其颜色深浅与蛋白质含量成正比；入max=560nm可用吸收光度法进行 比色测定。（2）测定标准曲线绘制以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质样，按蛋白质 含量40、50、60、70、80、90、100、110mg称取样品8份于纳氏比色 管中，各加入lmlCC14 （阻滞淀粉、还原糖、色素、类脂物溶解，消 除干扰）加入双缩月尿试剂（酒石酸钾钠，KOH, CuSO4） 50.00ml振摇 均匀（lOmin）静置lh,取上层清液离心5min,再测Xmax=560nm时 的A

5、（水作参比）。样品测定准确称取适量样品，同样方法测样品的A。（3）计算蛋白质（%） =（X/W）xlOOx从标准曲线中查得蛋白质含量，mgw测定样液相当样品质量，mg（4）说明高脂肪样品，先用酸抽出弃之。假设有不溶物可抽出蛋白质后再测。2、水杨酸比色法（1）原理:样品中蛋白质经硫酸消化后转变为镂盐，与水杨酸钠作用生 成蓝色化合物，在入max=660nm处比色测定，求出含氮量，计算蛋白质 %（2）测定:标准曲线吸取含氮2.5|ig/ml的硫酸锻（NH4）2s04标准溶 液0、1.0. 2.0、3.0、4.0、5.0ml置于25ml容量瓶中,分别加入：空白酸 溶液2ml、磷酸盐缓冲液5m1、加水至

6、15m1、水杨酸钠5m1、3637恒 温水浴15min,加入次氯酸钠2.5ml,再在3637T恒温15min,加水至刻 度入max=660nm测A。样品处理：称取0.21.0g置于凯氏烧瓶中，加 入15ml浓H2so4, 0.5gCuSO4, 4.5g无水硫酸钠,小火加热沸腾后,进 行消化，待溶液澄清，呈暗绿色时，冷却，移至250ml容量瓶中，定容。 样品测定：吸取样液5m1 （必要时稀释）以下步骤同上“标准曲线”操 作。（3）计算蛋（%）=总氮（%） xF （6.25）X-含氮量|ig, k-样品稀释倍数，m-样品质量，go（4）说明：消化样品，当天测定，重现性好。严格控制反响温度 （363

7、7。0 ,因为影响显色。（四）氨基酸总量测定1、双指示剂甲醛滴定法（测定游离氨基酸） 有单指示剂滴定法、双指示剂滴定法。单指示剂有：百里酚猷，酚猷。双指示剂有：中性红一百里酚配。其原理均是用甲醛与NH2作用，使碱性消失，再用强碱滴定COOH。 测定：样品（溶液）（2030mg氨基酸+H2O+3滴中性红，用 O.INNaOH滴定至黄橙色（VI）样品+中性甲醛+3滴百里酚酉太， 摇，静Imin,用O.INNaOH滴定至淡蓝色（V2）。计算：氨基酸态氮（） =（V2-V1） xCx0.014/W*100式中：VI用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠的体积,V2用 百里酚酉太作指示剂滴定时耗氢氧化钠的体

8、积。2、电位滴定法（1）原理：加入甲醛，固定氨基碱性。用酸度计指示滴定终点，据加 入甲醛后耗用NaOH量计算蛋白质。适用于混浊及色深样品的直接滴定。（2）测定：样液用NaOH滴定至pH=7.58.2。加入中性20%甲醛后，用NaOH滴至pH=9.2。同时作空白试验。（3）计算:3、苗三酮比色法（1）原理氨基酸在碱性溶液中能与苗三酮作用生成蓝紫色化合物，入max-570nm 其颜色深浅与氨基酸含量成正比。（2）测定准确吸取lOOg/ml氨基酸标准溶液。0、1.0. 2.0、3.0、4.0、5.0.6.0ml至比色管中，补加水至相同体积。加入苗三酮、磷酸缓冲液各 1ml,水浴中加热15min0加水至（或转入容量瓶中）25ml,静置 15mino在570nm下以空白液为参比液，测A,绘制标准曲线。样品测定吸取样液15ml,用同样条件下测A,查出氨基酸（ig。（3）计算X氨基酸总量（mg%） =xlOOmxlOOO（五）个别氨基酸的测定，例：游离赖氨酸的测定原理赖氨酸与苗三酮在pH3的专一显色反响，在入=475nm处测A,分析 范围=0.075 0.2mg/ml。测定a标准曲线在试管中分别加入赖氨酸标准溶液（O.2mg/ml） 0.75. 1.0. 1.2