益生菌组合物对慢传输型便秘的改善作用

1、益生菌组合物对慢传输型便秘的改善作用慢传输型便秘是最常见的便秘类型之一1，是由肠道转运时间延长导致的慢性排便困难2。药物和手术治疗均会给患者带来不同程度的副作用，同时存在复发的可能性。使用益生菌制剂治疗便秘不易引起不良反应，受到越来越多的关注3-5。中国食品科学技术学会发布益生菌的科学共识(2022年版)，指出了益生菌的核心特征之一是保证有足够的数量，其功效发挥具有菌株特异性，益生功能需要在数量和菌株水平进行确认。相比使用单一菌株，复合菌株的人群适用性范围更广。盐酸洛哌丁胺是慢传输型便秘动物模型常用造模药物6-7，其机制是作用于肠壁阿片受体，阻止胆碱和前列腺素释放，从而抑制肠蠕动，延长肠道内容

2、物通过时间，促进水、电解质等吸收，导致动物肠转运时间延长，粪便数量、质量和含水量减少，出现便秘症状8。本研究通过盐酸洛哌丁胺诱导慢传输型便秘动物模型，研究益生菌组合配方在改善慢传输型便秘方面的作用。1 材料与方法1.1 材料和仪器1.1.1 实验材料与试剂益生菌组合物配方(鼠李糖乳杆菌LR-168、嗜酸乳杆菌LA-99和动物双歧杆菌BB-115)，仙乐健康科技股份有限公司。盐酸洛哌丁胺胶囊，西安杨森制药有限公司；活性炭粉，生工生物工程(上海)股份有限公司；小鼠胃动素(motilin, MTL)、胃泌素(gastrin, Gas)、P物质(substance P, SP)、内皮素(endothe

3、lin 1, ET-1)、生长抑素(somatostatin, SS)、血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)、肠道紧密连接蛋白、血清D-乳酸、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-, TNF-)、干扰素(interferon , IFN-)、白介素2(interleukin 2, IL-2)、白介素4(interleukin 4, IL-4)、白介素6(interleukin6, IL-6)、白介素10(interleukin 10, IL-10)、白介素12(interleukin 12, IL-12)、白介素17(inte

4、rleukin, IL-17)和抗体(sIgA)ELISA试剂盒，南京森贝伽生物科技有限公司；阿拉伯树胶粉，国药集团化学试剂公司。墨汁配制方法：称取阿拉伯胶100 g，与800 mL水混合均匀，加热煮沸至溶液透明,再加入活性炭50 g，煮沸3次。待溶液冷却后，用水稀释定容至1 000 mL，4 保存。1.1.2 仪器设备PB300-N电子天平，Mettler Toledo；Multi-scan Go多功能酶标仪，美国Thermo公司；CFX384实时PCR系统，BIO-RAD公司。1.2 实验方法1.2.1 实验动物设计6周龄雄性SPF级BABL/c小鼠，北京维通利华公司。实验方案经江南大学伦

5、理委员会批准(JN.No20221115b0500110)，并按照欧盟指导方针(2022/63/EU)执行。饲养环境保持在(232)，相对湿度(5010)%，12 h/12 h明暗交替，实验期间，小鼠自由进水进食。1.2.2 模型建立与分组50只小鼠随机分成空白组、模型组(盐酸洛哌丁胺)、阳性对照组(盐酸洛哌丁胺+动物双歧杆菌BB-12：5108CFU)、低剂量组(盐酸洛哌丁胺+益生菌组合物：5108CFU)、高剂量组(盐酸洛哌丁胺+益生菌组合物：5109CFU)，每组10只。根据保健食品检验与评价技术规范(2022版)对通便功能的评价方法，使用盐酸洛哌丁胺造模便秘模型，通过检测首粒黑便排出时

6、间判定造模成功与否。小鼠适应7 d后开始灌胃，从第814天空白组、模型组灌胃0.2 mL生理盐水，阳性对照组、低剂量组、高剂量组灌胃相应的用0.2 mL生理盐水重悬的菌粉悬液。从第1521天，模型组、灌菌组灌胃用0.2 mL生理盐水重悬的盐酸洛哌丁胺悬液(10 mg/kg bw)，空白组灌胃0.2 mL生理盐水，1 h后空白组、模型组灌胃0.2 mL生理盐水，灌菌组灌胃相应的用0.2 mL生理盐水重悬的菌粉悬液。第22天处死小鼠取样用作后续实验。1.2.3 小鼠首粒黑便时间、黑便粒数、黑便质量及小肠推进率的测定第21天，空白组给予0.2 mL生理盐水溶液、模型组和灌菌组均给予0.2 mL生理盐

7、水溶液重悬的盐酸洛哌丁胺悬液(10 mg/kg bw)，1 h后，各组菌灌胃墨汁，从灌胃墨汁开始，记录每一只小鼠排首粒黑便的时间、6 h黑便粒数和黑便质量。第22天空白组给予0.2 mL生理盐水溶液、模型组和灌菌组均给予0.2 mL生理盐水溶液重悬的盐酸洛哌丁胺悬液(10 mg/kg bw)，30 min后，空白组和模型组灌胃墨汁，灌菌组灌胃含各自灌胃内容物的墨汁。30 min后处死小鼠，打开腹腔分离肠系膜，剪取肠管，测定小肠总长度L1，墨汁推进长度L2，按公式(1)计算小肠推进率：小肠推进率/%=L2/L1100(1)1.2.4 小鼠血清、结肠组织匀浆胃肠调节肽的检测将收集到的小鼠血液静置2

8、 h，3 000g离心15 min后获得血清，参照试剂盒说明书进行实验，根据标准曲线计算中血清中胃肠调节肽含量。用预冷的PBS冲洗结肠组织，去除残留血液，剔除周围脂肪组织，称重后将其剪碎。将剪碎的组织与PBS按照料液比19(gmL)在组织破碎仪上进行破碎，最后5 000g离心10 min，取上清液检测胃肠调节肽浓度。具体操作参照试剂盒说明书。1.2.5 小鼠血清细胞因子的检测使用对应ELISA试剂盒小鼠血清中细胞因子含量，具体步骤参考试剂盒说明书。1.2.6 小鼠结肠组织AQP3和c-kit基因表达水平检测取超低温冰箱冻存新鲜结肠组织，采用实时荧光定量聚合酶链反应(fluorescence r

9、eal time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)来测定相关蛋白的表达量。严格按说明书用Trizol法提取总RNA，1 g总RNA经逆转录合成30 L cDNA，基因引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。AQP3基因、c-kit基因、actin基因引物序列如表1所示。表1AQP3、c-kit和actin引物序列Table 1 Primer sequences ofAQP3,c-kitandactin根据反应曲线得到各组样品目的基因和内参基因的阈值循环数(cycle threshold，Ct)，采用2-Ct方法进行数据分析，Ct

10、=CtMean目的基因-CtMean内参基因；Ct=Ct实验组-Ct对照组；实验组和对照组的基因表达差异为2-Ct。空白对照组的数值为1。以逆转录得到的cDNA为模板，进行qRT-PCR，反应体系共10 L。反应条件为：95 2 min，95 30 s，59 30 s，72 20 s，共38个循环。以actin基因为内参，CFX96 Manager软件分析结果。1.3 统计分析应用GraphPad prism8作图，所有的数据采用SPSS 21.0进行显著性分析，应用one-way ANOVA进行组间比较，所有数据均以平均数标准差表示，P0.05表示差异显著。2 结果与分析2.1 益生菌组合物

11、对小鼠肠道运动和排便情况影响如图1所示，与空白组相比，模型组小鼠的肠道转运及排便情况发生显著变化(P0.05)，主要包括小肠推进率下降，首粒黑便排出时间延长，6 h黑便排出粒数减少，黑便质量降低。这表明洛哌丁胺造模慢传输型便秘成功。与阳性对照组相比，益生菌组合配方低、高剂量在小肠推进率、首粒时间、黑便粒数和黑便质量方面没有统计学差异。相比模型组，各干预组(阳性对照组、益生菌组合物低、高剂量组)在肠道运动和排便情况方面得到显著改善(P0.05)。益生菌组合物能够提高肠转运效率，降低排便时间，改善便秘，效果与阳性对照一致。A-空白组；B-模型组；C-阳性对照组；D-低剂量组；E-高剂量组(以下各图

12、与此相同) a-小肠推进率；b-首粒黑便时间；c-黑便粒数；d-黑便质量图1 益生菌组合物配方对洛哌丁胺引起的便秘小鼠肠道排泄影响Fig.1 Effects of probiotics complex on excretion in loperamide-induced constipation mouse model 注：组间不同字母表示差异显著(P0.05)(下同)2.2 益生菌组合物对小鼠血清和结肠组织胃肠调节肽的影响临床研究表明，胃肠调剂肽在便秘和正常状态下的分泌存在差异，为探究益生菌组合物的作用机制，对其表达进行检测。血清胃肠调节肽含量如图2所示。模型组相比空白组在胃肠调节肽方面差异

13、显著(P0.05)，具体表现为兴奋性胃肠调节肽(SP、MTL、Gas)在造模后含量下降，抑制性胃肠调节肽(VIP、SS、ET-1)造模后含量上升。益生菌组合配方灌胃后，抑制性胃肠调节肽(VIP、SS、ET-1)能够恢复至空白组水平，低、高剂量无显著差异。相比模型组，灌胃益生菌组合物配方低、高剂量组的兴奋性胃肠调节肽(SP、MTL、Gas)含量，表现提升效果，其中血清SP、MTL含量在低剂量组中与空白组无统计学差异， Gas含量在高剂量组中与空白组无显著差异。与阳性对照组相比，低剂量组在促进SP表达水平上显著优于阳性对照，而高剂量组在抑制ET-1的表达水平显著优于阳性对照。a-SP；b-MTL；

14、c-Gas；d-VIP；e-SS；f-ET-1图2 益生菌组合物对洛哌丁胺引起的便秘小鼠血清中胃肠调节肽的影响Fig.2 Effects of probiotics complex on gastrointestinal hormones in serum samples of loperamide-induced constipation结肠组织胃肠调节肽水平如图3所示，与模型组相比，灌胃益生菌组合物配方后，兴奋性胃肠调节肽(SP、MTL、Gas)含量显著上升，抑制性胃肠调节肽(VIP、SS、ET-1)含量显著下降。在促进MTL和Gas分泌上，阳性对照比益生菌组合物更有优势，而在抑制SS、E

15、T-1分泌中，益生菌组合物则更具优势。a-SP；b-MTL；c-Gas；d-VIP；e-SS；f-ET-1图3 益生菌组合物对洛哌丁胺引起的便秘小鼠结肠组织中胃肠调节肽的影响Fig.3 Effects of probiotics complex on gastrointestinal hormones in colon tissues of loperamide-induced constipation mouse上述结果表明，益生菌组合物配方通过促进兴奋性胃肠调节肽分泌，同时降低抑制性胃肠调节肽产生来缓解洛哌丁胺诱导的慢传输型便秘，且血清和结肠组织的结果趋势一致。2.3 益生菌组合物对小鼠血

16、清细胞因子的影响肠道系统与免疫息息相关，益生菌有调节免疫的能力，通过研究细胞因子水平，能够进一步阐释益生菌缓解便秘的机制。小鼠血清细胞因子水平如表2及表3所示，细胞因子IL-4水平，高剂量组与空白组、阳性对照组之间差异显著；细胞因子IL-6水平，模型组与低、高剂量组之间差异显著，其余各组细胞因子之间基本无差异。结果表明灌胃益生菌组合物基本不影响血清细胞因子水平。表2 益生菌组合物对洛哌丁胺引起的便秘小鼠细胞因子的影响Table 2 Effects of probiotics complex on serum cytokines in a loperamide-induced constipat

17、ion mouse model注：同列不同字母表示差异显著(P0.05)(下同)表3 益生菌组合物对洛哌丁胺引起的便秘小鼠血清指标的影响Table 3 Effects of probiotics complex on serum indicators in a loperamide-induced constipation mouse model2.4 益生菌组合物对小鼠结肠组织AQP3和c-kit基因表达量的影响水通道蛋白AQP3在肠道水转运过程中起到重要作用，Cajal间质细胞(intestinal cells of Cajal，ICC)参与慢传输便秘的形成机制，而c-kit是其特异性标志

18、物，通过研究AQP3和c-kit的基因表达水平可以探索益生菌缓解便秘的机制。如图4所示，与模型组相比，灌菌组显著提高AQP3和c-kit基因表达水平(P0.05)，且结果与空白组及阳性对照组无统计学差异。益生菌组合物低、高剂量无显著差异。结果表明益生菌组合物能够通过恢复AQP3和c-kit基因的转录水平来改善便秘。图4 益生菌组合物对AQP3和c-kit基因表达量的影响Fig.4 Effects of probiotics complex on expression ofAQP3 andc-kitin mouse colon3 结论与讨论慢传输型便秘是功能性便秘的一种，主要症状包括排便困难、排

19、便次数减少、排便时间延长或排便不尽。肠内容物的移动主要通过蠕动进行9，通过测定小肠推进率可以了解到肠道蠕动情况，小肠推进率越高越有利于粪便的排出10。本研究通过盐酸洛哌丁胺造模便秘小鼠，益生菌组合物干预后能够显著提高小肠推进率，首粒黑便时间，黑便粒数和黑便质量，并且低剂量组和高剂量组之间无统计学差异。研究表明胃肠调节肽SP、MTL、Gas、VIP、SS和ET-1在肠胃运动调节中起重要作用，其表达水平与便秘症状密切相关。其中，SP、MTL和Gas是兴奋性神经递质，VIP、SS和ET-1是抑制性神经递质11-13。提高SP、MTL和Gas水平能够加速肠道蠕动，提高转运率，改善便秘症状，而VIP、SS和ET-1是减慢肠转运时间的重要因素，降低其分泌，可以缓解慢传输型