酪氨酸激酶抑制剂逆转黏附诱导的骨髓瘤细胞的耐药性

1、酪氨酸激酶按捺剂逆转黏附诱导的骨髓瘤细胞的耐药性潘耀柱，陈协群，高广勋，顾宏涛，张永清，董宝侠，白庆咸，朱华峰【摘要】为了探究酪氨酸激酶按捺剂STI571对RPI8226细胞黏附、黏附诱导耐药以及靶细胞Ra1RNA表达的影响，本研究接纳结晶紫染色法阐发了RPI8226细胞与纤连卵白fibrnetin，FN的黏附率，用TT法检测瘤细胞的增殖性，并用半定量RT-PR研究Ra1RNA程度的变革。效果表现：RPI8226细胞与FN黏附1、6、12小时，其黏附率别离为(43.712.18)%、(55.631.56)%、(63.422.46)%；用20l/LSTI571处置惩罚1、6、12小时后黏附率别离

2、落为(15.121.04)%、(17.581.32)%、(17.241.59)%；组间差异明显P0.05；阿霉素作用后，FN黏附组细胞I50值1.460.04l/L明显高于BSA组0.780.03l/L(P0.05)；FN团结STI571组I50值(0.810.05)l/L与BSA团结STI571组0.740.02l/L比拟无明显性差异P0.05，但却低于FN组(P0.05)；半定量RT-PR表现，Ra1RNA程度在20l/LSTI571处置惩罚14小时后显着落落。结论：STI571能低落RPI8226细胞与FN的黏附率、逆转黏附介导的阿霉素耐药，而且可以下调其Ra1RNA程度。【关键词】骨髓

3、瘤细胞TyrsineKinaseInhibitrReversesAdriayinResistaneediatedbyellAdhesininRPI8226ellsKeyrdstyrsine-kinaseinhibitr;STI571;yelaell;RPI8226ell;adhesin;drugresistane多发性骨髓瘤至今之以是被以为是一种难以治愈的浆细胞恶性肿瘤，是由于瘤细胞终极会产生多药耐药，此中细胞与细胞外基质extraellularatrix，E间黏附在耐药中占据紧张的职位，作为细胞与E之间作用的重要介导分子整合卵白integrin与纤连卵白fibrnetin，FN)团结对凋亡按

4、捺、细胞存活具有紧张作用。Daian等1创造，经阿霉素adriayin，Adr处置惩罚后，与FN黏附的骨髓瘤细胞比不黏附者具有显着的生长上风和较低的凋亡率，他们称这一征象为细胞黏附介导的耐药elladhesinediateddrugresistane，A-DR，接纳关闭性抗体阻断整合卵白与FN间的彼此作用后，瘤细胞与FN间的黏附率显着落落，A-DR得以完全逆转。肌动卵白atin细胞骨架重构与细胞黏附严密相干，Abl酪氨酸激酶与RhGTP酶Ra1是atin细胞骨架的紧张调控分子。因此，Abl与Ra1极大概涉及细胞与细胞外基质(entraellularatrix，E)间的黏附历程以及靶细胞的A-D

5、R形成。那么按捺Abl激酶活性可否逆转黏附诱导的细胞耐药呢？针对这一题目，我们以人骨髓瘤细胞株RPI8226为研究工具，进一步探究Abl激酶按捺剂STI571对细胞A-DR的逆转作用及其相干介导机理。质料和要领试剂STI571由诺华制药公司惠赠，分子式为29H31N7H4S3，分子量589.7。1粒胶囊含STI571100g，用二甲亚砜DS，Ars产物充实溶解，离心去沉渣，以无菌注射用水稀释至1l/L，分装，-20贮存。小牛血清购自杭州四序青生物工程质料。四氮唑蓝TT、结晶紫rystalvilet、阿霉素均为Siga产物。纤连卵白为BetnDikinsn公司产物，注射用水溶解，分装，-20冻存

6、。Taq酶购自负连TaKaRa公司；反转录试剂盒购Prega公司；RNA提取试剂TRIzL购自Invitrgen公司；Ra1及内参照3-磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH引物均由上海Sangn公司合成。细胞造就多发性骨髓瘤细胞系RPI8226细胞泉源于AT，由第四军医大学病理学教研室惠赠。细胞造就于含100l/L灭活胎牛血清的RPI1640造就液中，置5%2、饱和湿度、37造就箱中悬浮造就，2-3天传代1次，实行用细胞处于指数生恒久。黏附实行用无菌过滤的TSbuffer(20l/LTris-Hl，150l/LNal，1l/Lal2，2l/Lgl2，pH8.0)2别离配制50g/l的FN及1%BSA，每

7、孔50l包被96孔板，4留宿，用1%BSA关闭2小时。实行分为4组：FN组：单纯用FN(50g/l)包被；比拟组BSA组：单纯用1%BSA包被；STI571+FN组；STI571+BSA组。RPI8226细胞经无血清RPI1640造就12小时，并以20l/L浓度的STI571(行细胞毒预实行测得)预孵育2小时后，按2.0104细胞/孔，种入96孔板，每组平行3孔。37、5%2别离造就1、6、12小时期间不去除STI571。用RPI1640造就液洗板3次，70%甲醇结实10分钟，洗板晾干。0.02%结晶紫染色10分钟1，PBS洗去多余染料，再以0.2%TritnX-100溶解细胞，酶联免疫仪上测

8、定各孔570nD值，以含2.0104细胞/孔为总D值100%。细胞黏附率(%)=实行组D值/总D值100%。TT检测实行分4组，每组设3个复孔：FN+Adr组；BSA+Adr组；STI571+Adr+FN组；STI571+Adr+BSA组。FN包被及STI571处置惩罚同前。取指数生恒久RPI8226细胞按1.0104细胞/孔种入96孔板，黏附12小时，每组别离参加以下浓度Adr：0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0l/L，作用1小时，离心弃上清，加完全RPI1640液造就24小时后，参加TT溶液5g/l10l，37孵育4小时，每孔参加100l10%SDS含0.01NHl，充实溶解

9、结晶物3，570n波长测定各孔D值，实行重复3次，取均匀值。生长按捺率()=(1-试验组A值/比拟组A值)100。RT-PR检测取指数生恒久细胞分为20l/LSTI571处置惩罚组与空缺比拟组，1106个细胞造就14小时后，接纳TRIzL试剂提取总RNA。RNA反转录按试剂盒说明书举行。将反转录产物DNA于95变性5分钟，开始PR的热循环：94变性40秒，51退火40秒，72延伸40秒，共28个循环，末了一个循环72延伸10分钟，4保存。Ra1及GAPDH引物方案参照文献4。Ra1上游引物为5-AGGAAGAGAAAATGTG-3，卑劣引物为5-AGAAAGGTAAAAGGT-3，产物长度为8

10、0bp；GAPDH上游引物为5-TGGAGTAAGGATTTGGTGTA-3，卑劣引物为5-TGGATGGATGTGGTATGAGT-3，产物长度为525bp。PR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像体系举行灰度值扫描，并以软件Genetls阐发，以目的条带与内参照条带的比值Ra1/GAPDH代表目的基因RNA相对程度。统计学阐发应用SPSS10.0处置惩罚数据，行T-test阐发。效果STI571对RPI8226细胞黏附的按捺作用随着时间延伸，RPI8226细胞与FN的黏附率渐渐上升，1、6、12小时黏附率别离为(43.712.18)%、(55.631.56)%、(63.422.46)%；

11、20l/LSTI571处置惩罚组1、6、12小时后黏附率别离落为(15.121.04)%、(17.581.32)%、(17.241.59)%；与比拟组比拟相差明显(P0.05)，表白STI571能明显低落RPI8226细胞与FN的黏附图1。STI571逆转RPI8226细胞A-DR经Adr作用后，BSA比拟组RPI8226细胞凋亡，并有精良的浓度依靠干系，其I50为0.780.03l/L；靶细胞与FN黏附后Adr诱导的细胞凋亡显着削弱，其I501.460.04l/L明显高于BSA组(P0.05)，表白靶细胞黏附能进步其耐受Adr细胞毒作用，即产生了细胞耐药；而FN团结STI571处置惩罚组I5

12、0(0.810.05)l/L，显着低于FN组(P0.05)，说明STI571能逆转骨髓瘤细胞因黏附介导的耐药；BSA团结STI571组I500.740.02l/L与BSA组0.780.03)l/L比拟无明显性差异P0.05，说明STI571下调靶细胞I50作用并非是由于STI571与Adr的协同作用所引起的图2。STI571下调RPI8226细胞Ra1RNA表达Ra1RNA在RPI8226细胞中高表达，其RP-PR产物相对灰度值为1.650.15(lane1)，20l/LSTI571处置惩罚瘤细胞14小时后灰度值落为0.810.18(lane2)，表白STI571可以或许下调靶细胞Ra1RNA

13、表达图3。讨论Abl属于非受体型卵白酪氨酸激酶家属成员，大部门定位于核内，少部门在胞浆。其成效因Abl在细胞内定位差异而差异，核内Abl重要涉及细胞周期、凋亡等历程，而胞浆Abl那么到场细胞黏附、细胞骨架重构调控。细胞成效状态影响Abl定位及生物学活性。比方，成纤维细胞和FN黏附团结后，Abl激酶活性可上升1.9-6.8倍5，6，并能快速从核内到胞浆，团结到纤维状肌动卵白filaentatin，F-atin，促使F-atin聚合及粘着斑(faladhesin)形成7，8。这表白Abl激酶在细胞黏附历程中发挥着紧张作用。鉴于差异范例细胞的黏附历程大概具有某些配合的生物学特性，我们推测Abl激酶也

14、大概到场细胞的黏附调控历程。2002年De-Vs等9接纳寡核苷酸阵列阐发技能证明，Abl基因在恶性浆细胞中的表达高于正常浆细胞2.9倍。这一终究为研究Abl与细胞黏附间的干系提供了生化基矗那么可否用Abl酪氨酸激酶按捺剂STI571来按捺骨髓瘤细胞的黏附，从而逆转其A-DR？我们用FN黏附RPI8226细胞1、6、12小时，黏附率依次递增，别离为(43.712.18)%、(55.631.56)%、(63.422.46)%；而对应的STI571处置惩罚组黏附率别离为(15.121.04)%、(17.581.32)%、(17.241.59)%；组间差异明显，说明STI571能显着按捺细胞的黏附，与此同时，靶细胞对阿霉素的I50落落。这一效果表白，STI571可以或许部门逆转细胞的耐药性，也为进一步研究Abl调控F-atin聚合以及A-DR形成提供了开端根据。本研究还创造，20l/LSTI571可明显下调骨髓瘤细胞Ra1RNA程度。Ra1属于小G卵白Rh家属成员，到场atin细胞骨架调控，对细胞黏附历程有紧张影响10，11，活化的Ra1可促进细胞粘着斑形成，这种作用可以