关节软骨撞击伤后软骨细胞凋亡的实验研究

1、关节软骨撞击伤后软骨细胞凋亡的实验研究【摘要】目的用TUNEL标记法和透射电镜来观察软骨撞击伤后软骨细胞凋亡的演变情况。方法56只安康成年新西兰大白兔，随机分高、低能量两组，每组28只，随机选取一侧后肢为实验组，另一侧为对照组；不同重量的击锤撞击股骨内侧髁软骨面致不同的损伤。术后4d，1、2、4、8、16、32周搜集标本，每个时间组4只兔子，进展TUNEL标记法和透射电镜来观察软骨细胞的凋亡。结果对照组标本中在软骨的中间层和钙化层，出现凋亡细胞。低能量组中，伤后4d，1、2周的标本中，软骨的移形层和过渡层出现凋亡细胞，细胞凋亡率与对照组之间无统计学意义；4周后的标本中凋亡细胞明显减少，细胞凋亡

2、率与对照组之间无统计学意义。高能量组中，伤后4d软骨浅表层和移形层中出现凋亡细胞，而且伤后时间越长凋亡细胞所占比率越大，细胞凋亡率与对照组之间有统计学意义。结论软骨高、低能量撞击伤后早期软骨细胞均出现凋亡，凋亡率高于对照组；但低能量伤后4周软骨细胞凋亡率恢复到对照组程度；高能量伤后软骨细胞凋亡率随时间逐渐增高。【关键词】软骨损伤；软骨细胞；凋亡；创伤性骨关节炎近来的研究说明，骨关节炎和体外软骨损伤模型中，可观察到软骨细胞的凋亡。随着骨关节炎严重程度加重，软骨细胞的凋亡率也随之增加，机械损伤也能诱导软骨细胞的凋亡，后者可能是软骨细胞对机械损伤的最早反响之一1,2。体内关节软骨受到撞击伤后，软骨细

3、胞的凋亡率如何演变人们还缺乏足够的认识。本实验在Neberry、Vrahas模型的根底上，建立兔股骨内侧髁软骨损伤不同的模型，用TUNEL标记法和透射电镜观察软骨损伤后软骨细胞凋亡的演变情况。1材料与方法1.1动物及分组56只安康成年新西兰大白兔，雌雄不限，体重3.03.5kg，随机分为轻、重2组，每组28只，随机选取一侧后肢为实验组，另一侧为对照组。再随机分为术后4d，1、2、4、8、16、32周7个时间组，每组4只动物。1.2关节软骨损伤模型的建立1.2.15水合氯醛1.25lkg腹腔注射麻醉，取仰卧位，脱毛，常规消毒铺巾。1.2.2膝关节内侧纵形切口，长3，依次切开皮肤、皮下组织、深筋膜

4、、关节囊，将髌骨外翻，膝关节屈曲120，使股骨干与程度面垂直，骨盆固定带固定骨盆，用大腿固定带固定大腿防止撞击时不稳定。1.2.3用1.33、0.43kg的击锤分别于46、20高处通过导杆自由坠落，产生的能量为6.3J(能造成胶原网架断裂)和0.9J(不能造成胶原网架断裂)2、3，再通过撞击体致股骨内侧髁软骨面的损伤。对照侧不行撞击，余步骤同试验组。术毕庆大霉素生理盐水冲洗关节腔，逐层缝合伤口。麻醉清醒后笼内自由活动。术后肌注青霉素20万单位，每日2次，连用3d。(4)于术后4d，1、2、4、8、16、32周搜集标本，进展TUNEL标记法和透射电镜来观察软骨细胞的凋亡。1.3形态学观察1.3.

5、1取材、固定各组于观察期满后，在一样位置用锋利双面刀片软骨下骨处切取0.50.40.2的软骨，不取软骨下骨，防止了因标本脱钙过程中破坏细胞造成假阳性。标本切成2等份，1份立即置于10中性福尔马林溶液中在室温下固定24h后，石蜡包埋组织块，作连续切片，片厚为51，制成病理切片备用。另1份备做透射电镜之用。1.5统计学处理用SPSS12.0统计软件包，按高、低能量组与相应对照组分别进展两两比拟，采用t检验，取95可信区间，观察各实验组与对照组的软骨细胞凋亡率有无统计学差异。2结果术后所有实验动物均存活至预定取材时间，切口愈合好，无1例感染。2.1TUNEL标记法软骨细胞凋亡率的观测软骨细胞核呈橙黄

6、色的为凋亡细胞，蓝色的为正常细胞。对照组标本中在软骨的中间层和钙化层，出现凋亡细胞。低能量组中，伤后4d，1、2周的标本中，软骨的移形层和过渡层出现凋亡细胞，细胞凋亡率与对照组之间无统计学意义;4周后的标本中凋亡细胞明显减少，细胞凋亡率与对照组之间无统计学意义(P0.01)(图1、2)。高能量组中，伤后4d软骨浅表层和移形层中出现凋亡细胞，且伤后时间越长凋亡细胞所占比率越大，细胞凋亡率与对照组之间有统计学意义(图3、4)。2.2透射电镜高、低能量撞击组软骨细胞凋亡的特征性表现为：细胞偏离胞周基质，胞浆内空泡形成，细胞器减少，残存粗面内质网扩张，核膜不规那么，核固缩或细胞碎裂，染色质浓缩、边聚(

7、图5)。对照组的胞周基质明晰浓密，细胞位于陷窝内，软骨细胞胞膜及核膜完好，胞浆内细胞器明晰可见，胞周基质明晰浓密，内质网、线粒体和高尔基体等细胞器丰富(图6)。3讨论在正常关节软骨中，1软骨细胞可见凋亡征象，凋亡主要发生于软骨肥大层，随着年龄的增加，软骨细胞凋亡率也逐步增加。骨关节炎中可见50的软骨细胞凋亡，可发生于软骨全层。软骨细胞的异常死亡势必影响软骨分解及合成代谢的动态平衡，可见，软骨细胞异常凋亡参与了骨关节炎的病理过程。机械损伤可以引起软骨细胞的死亡，但是死亡形式是通过凋亡或是坏死还有待进一步证实。Te等3用环钻造成软骨损伤后，光学显微镜、透射电镜和TUNEL法观察软骨细胞的死亡形式，

8、在伤口的边缘出现软骨细胞凋亡，表现为细胞核浓缩和固缩，胞浆萎缩，细胞偏离胞周基质，这与本研究中观察到的软骨细胞凋亡情况相一致。Lening等4在体外用230Pa压力撞击牛的软骨，采用TUNEL法观察软骨细胞的凋亡，发如今中度撞击会导致软骨细胞凋亡的明显增加，软骨在撞击伤后，出现其它变化时，凋亡是最早出现的反响形式之一。DLia等5在体外将机械力加载到培养牛的关节软骨细胞上，发现软骨细胞凋亡率随加载力的增加而增加。进一步通过电镜和原位末端DNA片段标记技术证实，培养牛的软骨细胞受到创伤后，邻近损伤处的软骨细胞凋亡率也明显增加。本研究分别用6.3、0.9J不同能量撞击兔股骨内侧髁造成软骨不同的损伤

9、，伤后4d，1、2、4、8、16、32周取标本，TUNEL法和透射电镜法来观测软骨细胞的凋亡，有其特异性和敏感性。结果说明，关节软骨被撞击后软骨细胞均出现凋亡，凋亡的软骨细胞以浅表层和中间层较多，高能量伤后软骨细胞的凋亡率明显较低能量组高，伤后时间越长，细胞凋亡现象越重。而低能量伤后4d也出现凋亡，4周后细胞凋亡现象不再明显。由此作者认为，高能量伤不但造成细胞损伤，而且软骨有裂隙，胶原纤维网架断裂，完好的软骨细胞不能修复此类损伤，结果造成软骨细胞受到长期反复的慢性损伤，导致凋亡进一步加重，这样使胶原纤维网架遭到进一步损伤，形成恶性循环，以致凋亡程度随伤后时间延长而加重。低能量伤开场出现的凋亡说

10、明在撞击时直接使软骨细胞受到损伤，但由于胶原纤维没有断裂，使软骨细胞免遭进一步损伤，才出现其损伤后4周软骨细胞凋亡率与对照组的差异无统计学意义。通过本研究说明，软骨的损伤中，软骨细胞的凋亡可能是促使软骨退变的重要因素之一，但胶原纤维网架是否完好也许对软骨的持续损伤更重要。【参考文献】1stursJG,DangA,KiHT.parisnfhndryteapptsisinvivandinvitrfllingatuestehndralinjuryJ.JrthpRes,2022,22:678-683.2王东明.膝关节软骨钝性损伤的研究进展J.中国矫形外科杂志，2022,13(16):1263-1265.3TeSR,KanAPL,HannA,etal.Thereatinfartiularartilagetexperientalunding.TherlefapptsisJ.ArthritisRheu，2000，43:215-225.4LeningA,JanesIE,LevenstnE,etal.Injuriusehanialpressinfbvineartiu