灰树花子实体多糖中

1、灰树花子实体多糖中【关键词】灰树花；,多糖,-葡聚糖；,酶摘要：目的讨论灰树花子实体多糖中葡聚糖含量的测定方法。方法多糖粗提物依次用高温淀粉酶、木瓜蛋白酶和1，4葡萄糖水解酶水解，通过测定其中葡萄糖的含量计算葡聚糖的含量。结果确定了测定方法中几种酶的用量。在0300gL-1范围内线性关系良好，测得灰树花子实体多糖中葡聚糖含量为3.26%3.51%，3组样品的平均回收率为90.5%。结论该方法操作简便，准确度高。关键词：灰树花；多糖-葡聚糖；酶EnzyatieasureentfgluansinPlysaharidesfGriflafrndsaAbstrat：bjetiveAnenzyatieth

2、dfranalysisfgluaninplysaharidesfGriflafrndsahasbeenstudied.ethdsAfterhydrlyzingbytherstableaylse,papainandaylglusidase,thevaluefgluseereeasuredandthententfgluanereputed.ResultsThedsagefseveralenzyeseredeterinedandthententfgluaninthesaplesereintherangef3.26%3.51%.Theaveragereveryas90.5%.nlusinTheenzy

3、atiethdissipleandithhighauray.Keyrds：Griflafrndsa;Plysaharide;gluans;Enzye灰树花GriflaFrndsa是一种药食兼用的珍贵大型真菌，其子实体中富含氨基酸、多糖以及微量元素等在内的多种营养成分1。日本学者通过对灰树花发酵。近20年的研究发现,灰树花中含有的活性多糖具有明显的抗HIV(艾滋病病毒)、抗肿瘤，改善免疫系统功能及调节血糖、血脂及胆固醇程度、降血压等作用2,3，且未发现有毒副作用。研究说明灰树花多糖的免疫活性与其中-葡聚糖有亲密的关系，因此-葡聚糖的含量成为衡量灰树花多糖活性的重要指标之一。本文对灰树花子实体多糖

4、中的-葡聚糖的含量的测定方法进展了研究，以期为进一步研究其与灰树花多糖的活性之间的关系奠定基矗1仪器与试剂1.1原料灰树花多糖粗提物，浙江方格药业。1.2仪器HH-2数显恒温水浴锅，SrvallSuperT21冷冻高速离心机，751型紫外分光光度计。1.3试剂高温淀粉酶20000Ul-1，宜兴市生物工程公司，木瓜蛋白酶19.2Ul-1，rthingtn公司，Aylglusidase(1,4-葡萄糖水解酶)73.8Ul-1，Siga公司。葡萄糖测定试剂盒，上海荣盛生物技术。2方法与结果2.1方法2.1.1高温淀粉酶用量确实定准确称取1.0g灰树花多糖粗提物6份，分别溶于40lpH6.0的磷酸缓冲

5、液中，振荡使其溶解，向其中参加一定量的高温淀粉酶，放入100水浴中反响30in，冷却至室温。离心8000rin-1,10in，取上清液，参加4倍体积的95%乙醇。离心8000rin-1,10in，沉淀用蒸馏水定容至300l，即得样品溶液。汲取样品溶液0.1l，各以水补至1.0l，用蒽酮硫酸法于620n测吸光度值。结果见图1。由图1可知,当高温淀粉酶的用量到达3000Ug-1(多糖粗提物)后,再增加酶的用量，620n测得的吸光度值变化不大。因此,确定高温淀粉酶的用量为3000Ug-1(多糖粗提物)。图1高温淀粉酶的用量对水解效果的影响(略)2.1.2木瓜蛋白酶用量确实定准确称取1.0g灰树花多糖

6、粗提物6份，分别溶于40lpH6.0的磷酸缓冲液中，振荡使其溶解，并调节pH值到7.5，依次称取一定量的木瓜酶，以磷酸缓冲液溶解，与已进展过第一步酶解后的多糖溶液充分混匀后置于60水浴锅中加热30in，冷却至室温。离心8000r/in,10in，取上层清液，参加4倍体积的95%乙醇。离心8000r/in,10in，沉淀用蒸馏水定容至400l，即得样品溶液。汲取样品溶液液0.1l，各以水补至1.0l，于280n测定其吸光度值。结果见图2。从图2可以看出，当木瓜蛋白酶的用量为49Ug-1(多糖粗提物)时280n测定其吸收值最低，再增加酶的用量，紫外吸收又随之增加，因此确定木瓜蛋白酶的用量为49Ug

7、-1(多糖粗提物)。转贴于论文联盟.ll.2.1.31,4葡萄糖水解酶用量确实定准确称取1.0g灰树花多糖粗提物6份，分别溶于40l磷酸缓冲液中，振荡使其溶解。分别量取最适用量的淀粉酶和木瓜蛋白酶，按2.1和2.2项下的方法依次酶解。将酶解液的pH调至4.3，依次称取一定量的Aylglusidase，以磷酸缓冲液溶解。参加酶解液充分混匀后置于60水浴锅中加热30in，冷却至室温。离心8000r/in,10in，沉淀用蒸馏水定容至300l，即得样品溶液。汲取样品溶液0.1l，各以水补至1.0l，用蒽酮硫酸法于620n测吸光度值。结果见图3。图2木瓜蛋白酶的用量对水解效果的影响(略)图31,4葡萄

8、糖水解酶的用量对水解效果的影响(略)由图3可知，当Aylglusidase用量到达36.9Ug-1(多糖粗提物)后，再增加酶的用量，620n测得的吸光度值变化不大。可以认为这时葡聚糖中的糖苷键根本水解完全。因此确定Aylglusidase的最适用量为36.9Ug-1(多糖粗提物)。2.1.4灰树花多糖的处理准确称取1.0g灰树花多糖粗提物，用pH6.0的磷酸缓冲液40l溶解，振荡使其溶解，依次按最适用量参加上述3种酶进展水解。量取高温淀粉酶液0.15l(3000U)，与所得的多糖溶液一起放入100水浴中反响30in，冷却至室温。调节酶解液的pH值至7.5。精细称取木瓜蛋白酶2.5g(49U)，

9、用0.1lpH6.0的磷酸缓冲液溶解,与上述溶液充分混匀后置于60水浴锅中加热30in，冷却至室温。调节酶解液的pH值至4.3。精细称取Aylglusidase0.5g(36.9U)，用0.1lpH6.0的磷酸缓冲液溶解,与上述溶液充分混匀后置于60水浴锅中加热30in，冷却至室温。向其中参加4倍体积的95%乙醇，静置1h，离心4000rin-1,10in弃去上层清液。向沉淀局部参加72%硫酸15l，室温分解4h。再加水140l，置于100水浴中加热2h。用10lL-1NaH调pH值至7.0。将上述溶液定容至300l，离心4000rin-1，10in，取上层清液作为待测样品。2.1.5测定方法

10、用葡萄糖氧化酶过氧化物酶GD-PAP法4测定2.1.4项下样品溶液的葡萄糖含量。取蒸馏水、样品溶液各10l，分别参加含葡萄糖氧化酶和过氧化物酶的工作液1l，混匀，置37水浴15in，于505n测吸光度值。2.2线性范围准确量取浓度为0，50，100，150，200，250，300gL-1葡萄糖标准液各10l，按照2.1.5项下方法操作，测定吸光度值。以吸光度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标。结果说明在0300gL-1范围内吸光度值和葡萄糖浓度呈良好的线性关系，标准曲线方程为Y=0.0036X+0.005r2=0.9998。2.3回收率准确称取灰树花多糖粗提物共3份，分别参加一定量葡聚糖，按照2.

11、1.4和2.1.5项下方法操作，测定回收率。表1灰树花多糖中葡聚糖含量测定结果及回收率(略)2.4重复性取050302批号样品6份，按照2.1.4和2.1.5项下方法操作，测得葡聚糖的含量结果见表2。表2灰树花多糖中葡聚糖重复性实验测定结果(略)2.5样品测定取3批样品按照2.1.4和2.1.5项下方法操作，准确测得葡萄糖浓度后用下式计算-葡聚糖的含量。-葡聚糖的含量%=葡萄糖浓度g100l-130.9/原料质量(g)100式中0.9为校正系数。3批灰树花多糖样品050302，050316，050328测得的葡聚糖的含量分别为3.51%，3.26%，3.43%。3讨论3.1本实验对酶法测定灰树

12、花子实体-葡聚糖的方法进展了研究。测定过程中依次参加了3种酶对灰树花多糖粗体物进展处理，以去除影响测定的杂质。其中高温淀粉酶与1,4葡萄糖水解酶用于水解样品中的葡聚糖，而木瓜蛋白酶那么酶解去除了样品中的杂蛋白。本实验中确定了3种酶的用量。对于3种酶的水解效率还有待进一步的研究。3.2菲林氏溶液氧化复原滴定法是葡萄糖的测定中较为常用的测定方法，但其他具有复原才能的单糖会干扰测定结果，因此本实验参考了食品中葡萄糖含量的测定方法，采用了专一性较强的葡萄糖氧化酶过氧化物酶法，使得葡聚糖的测定更加准确，迅速。3.3本方法操作简便，准确度高，为进一步研究葡聚糖与灰树花多糖活性之间的关系奠定了基矗同时对于一些真菌多糖和植物多糖中的葡聚糖的测定也具有一定的参考价值。参考文献：1边杉，叶波平，奚涛，等.灰树花多糖的研究进展J.药物生物技术，2022，11(1)：60.2李小定，荣建华，吴谋成，等.灰数花多糖的抗肿瘤活性及对免疫功能的影响J.中药材，2022，261：31.3HirtadaKurushia,NrikK