板蓝根F022部位抗内毒素分子机理研究

1、板蓝根F022部位抗内毒素分子机理研究【关键词】板蓝根；,F022部位；,内毒素；,分子机理摘要：目的讨论板蓝根F022部位抗内毒素分子机理。方法内毒素定量检测法测定F022样品液对内毒素的破坏作用；研究样品液对内毒素致鼠巨噬细胞分泌炎性因子的抑制作用、对蛋白激酶APKp38活性的影响、对内毒素刺激鼠组织esinRNA分子表达及对内毒素诱导鼠体内TNF,IL6和N的抑制作用。结果1%F022对内毒素破坏率到达86.5%，F022能显著抑制内毒素刺激巨噬细胞分泌TNF，IL6程度；抑制内毒素刺激蛋白激酶APKp38活性；降低内毒素刺激鼠肝、肾、脾组织esinRNA和体内TNF，IL6和N等炎性因

2、子的表达。结论F022部位不仅直接破坏内毒素构造，且阻断内毒素引起的信号传导通路，从而抑制机体炎性因子的过度释放、抑制膜构造伸展刺突蛋白和丝裂原活化蛋白激酶的表达，从分子程度说明了板蓝根中活性部位F022抗内毒素的分子机理。关键词：板蓝根；F022部位；内毒素；分子机理StudiesntheAntiendtxileularehanisfF022frRadixIsatidisAbstrat：bjetiveTstudytheanti-endtxileularehanisfF022frRadixIsatidis.ethdsThententfF022pretreatedETasquantitative

3、lydeterinedithliulustestTheinhibitinfTNFandIL6furineperitnealarphagesstiulatedbyLPS,theleularexpressinfesinRNA,APKp38,TNF,IL6andNinietissuesinduedbyLPSerestudiedntheantiendtxiehanisfF022.ResultsItasfundthattheETredutinrateas86.5%,if1%F022asaddedtarphagesulturebefreadditinf50ngl1LPSPrdutinfTNF,IL6and

4、APKp38byarphagesereinhibitedinvitrF022rearkablydereasedtheleularexpressinfesinRNAinliver，kidney，spleeninduedbyLPSinieandinhibitedprdutinfTNF,IL6andNiniestiulatedbyLPS.nlusinF022frRadixIsatidisanntnlydestrythestruturefendtxin,butalsbstrutthesignaltransdutinpathaysfLPS.F022aybeastrngantiendtxinfratini

5、ndrugsresearhanddevelpent.Keyrds：RadixIsatidis;F022fratin;Endtxin;leularehanis内毒素(endtxin，ET)是革兰氏阴性菌细胞壁外膜中的脂多糖(1ipplysaharide，LPS)成分。可刺激机体防御系统过度释放炎性因子肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素6(IL6)及一氧化氮(N)等而引起发热、脓毒性休克、弥漫性血管内凝血(DI)、多器官功能衰竭综合征(DS)，以致死亡。中医对内毒素性疾病的早期表现常辨证为“实热证，内毒素是“热毒、邪毒的物质根底1。有关内毒素的研究一直是世界生物医学研究热点，而内毒素拮抗药的研究那

6、么是防治内毒素性疾病的重要策略之一。先前研究已证实板蓝根有抗大肠杆菌111B4内毒素作用2，3，我们从中挑选出抗内毒素活性强的F022部位4，5，为进一步讨论F022部位抗内毒素机理，本文研究了F022部位对内毒素致体内外分泌TNF，IL6和N的影响及对内毒素受体-膜构造伸展刺突蛋白(esin)和内毒素介导的胞内信号传导过程中丝裂原活化蛋白激酶(itgenativatingprtEinkinases，APK)p38激酶的影响。现报道如下。1器材1.1药品与试剂F022部位本室制备,冻干细菌内毒素工作标准品(Eli111B4，卫生部上海生物制品研究所，120EU支)；Tris缓冲液(pH72)；

7、细菌内毒素(4g/支，中国药品生物制品检定所)；TNF和IL6试剂盒(北京邦定泰克生物)；新生小牛血清(NBS，沈阳安迪生物高科技公司)；RPI1640细胞培养液(Gib公司)；0.9%氯化钠注射液(0.9%NS，连云港制药厂)；LPS(Eli2B，5g/支，Siga公司)用09%NS配制成100gL1；卡介苗(BG，50g/支,上海生物制品研究所)，实验前用0.9%NS配成10g/l；esinRNA原位杂交试剂盒(武汉博士德生物公司)，32P(DupntNEN产品)，APKp38多克隆抗体(Siga公司)，BP(髓磷脂碱性蛋白，Siga公司)。1.21%F022溶液配制取F0221g，加适当

8、PEG4000作助溶剂，加热熔化，加水稀释到100l，用NaH液调pH67，灭菌消毒备用。1.3动物57BL6小鼠(雌性，68周龄，华中科技大学同济医学院器官移植研究所)；昆明种小鼠(1722g，3周龄，雌雄各半，华中科技大学同济医学院实验动物中心)；BALB小鼠(1419g，华中科技大学同济医学院实验动物中心)。1.4仪器EDS98型细菌内毒素检测仪(北京金山川科技开展)；X型旋涡混合器(上海医科大学研究所)。1815T型2培养箱(Shel-Lab公司)；K3型酶标仪(LabsysteDragn公司)。2方法2.1F022破坏内毒素定量测定2.1.1内毒素液配制取内毒素工作标准品(120EU

9、支)参加1l细菌内毒素溶解水，于旋涡混合器振荡30s，即成120EUl内毒素液。2.1.2标准曲线制备分别取内毒素液适量，用细菌内毒素溶解水稀释成5.0，2.5，1.0，0.5，0.25和0.1EUl系列内毒素浓度()，各取02l参加鲎试剂中(双管法)，旋涡混合器振荡后迅速插入内毒素定量测定仪，记录凝胶形成时间(Tg)，用lgTg对lg作图，得标准曲线lgTg=2.800490.23326lg，r=0.9905，内毒素在0.15.0EU/l浓度对数与凝胶形成时间的对数呈线性关系，最低检出限为0.05EU/l。2.1.3回收率按上述方法，取鲎试剂5支，分别精细参加浓度为4EU/l内毒素液0.2l

10、，测定凝胶形成时间，按标准曲线计算浓度为(4.7260.243)EU/l，回收率为(118.1510.52)%。2.1.4样品测定取0.5lF022液与0.1l内毒素液混合，于水浴(371)温育(602)in，取0.1l溶液参加0.4l细菌内毒素溶解水，此为样品组，同时设立阳性对照组和阴性对照组，测定内毒素浓度。F022对内毒素的破坏率为：1(样品组阴性对照组)/(阳性对照组阴性对照组)100%。2.2F022对脂多糖致鼠巨噬细胞分泌TNF和IL6的影响2.2.1鼠巨噬细胞制备按文献6，取57BL/6小鼠，腹腔注射BG2g/只，4d后拉颈处死动物，在无菌条件下注入冰冷的RPI1640培养液5l

11、含80Ul1青霉素，100gl1链霉素，10Ul1肝素，轻揉腹部数次，抽取腹腔液，离心1500r/in，用无血清的RPI1640洗涤细胞2次，参加含10%灭活小牛血清的RPI1640培养液，调整细胞浓度为2106个/l，参加24孔培养板内，每孔1l，置37,5%2培养箱内培养2h后，用无血清的RPI1640洗去非粘附细胞，贴壁细胞即为巨噬细胞。2.2.2TNF和IL6的诱生按文献5将含1%样品液预处理巨噬细胞1h后，再参加终浓度为50ngl1的LPS，另设阴性对照组(RPI1640液)和阳性对照组,分别培养6h和24h后取上清液，于20保存待测。2.2.3TNF和IL6的定量检测ELISA法测

12、定各标准品和样品光密度值D,以各标准品浓度对D值作标准曲线，结果说明TNF和IL6浓度在0.110ngl1范围内与D值具有良好的线性关系。由标准曲线求算出待测样品的TNF和IL6的含量，作统计学t检验。TNF抑制率=1(样品组空白对照组)/(模型组空白对照组)100%。IL6抑制率的计算方法同上。2.3F022对脂多糖诱导P38丝裂原活化蛋白激酶的影响2.3.1细胞液制备与药物处理按2.2.1的方法制备细胞液，转移至24孔培养板上，于无菌培养箱中培养。将含1%F022的培养液1l预处理巨噬细胞1h后，再参加终浓度为50ngl1的LPS，另设阴性对照组和阳性对照组,分别培养6h后，检测细胞内AP

13、Kp38活性。2.3.2蛋白激酶APKp38活性测定按文献7，每孔细胞经冰冷磷酸缓冲液洗涤后参加1l细胞溶解液，细胞经冻融处理，离心(12000rin，4，30in)，取上清0.5l与5g特异性APKp38抗体于4共同孵育4h，搜集免疫复合物与预先吸附有抗鼠的琼脂培养基孵育30in，沉淀下的蛋白参加溶解液在25孵育25in，取100l点于P8/phsphellulse(磷酸纤维素滤纸)上，在液体闪烁仪上测定髓磷酸脂碱性蛋白32P的掺入量，结果以每分每毫克蛋白掺入32P的pl数(pl/gin表示)。2.4F022对脂多糖刺激鼠组织esinRNA表达影响2.4.1标本制备将18只小鼠随机分为样品组

14、A、阳性对照组B、阴性对照组，每组6只。实验前一周腹腔内注射BG2g/只,实验前12h禁食不禁水，实验当天给予A、组1%样品液0.4l/只，B组给予同等量0.9%NS灌胃，30in后，A、B组小鼠尾静脉注射LPS800ng/20g，9h后乙醚麻醉，取肝、脾、肾组织，立即用4%多聚甲醛固定。转贴于论文联盟.ll.2.4.2esinRNA原位杂交按常规操作将各组织切片，脱蜡入水，3%双氧水室温处理10in以灭活内源性过氧化物酶，暴露RNA核酸片段；切片上滴加3%柠檬酸新颖稀释的胃蛋白酶，37消化25in。充分洗涤后，按每张切片加20l含寡核苷酸探针的原位杂交液。于湿盒中，3740杂交过夜。每张切片

15、取2l杂交探针稳定液A和18杂交探针稳定液B混匀，加在切片上，再反响6h，2SS洗涤5in3次。滴加封闭液，3720in。滴加兔抗地高辛，3760in。充分洗涤后，滴加生物素化羊抗兔IgG，3720in。充分洗涤后，滴加SAB，3720in。DAB显色2030in，用苏木素复染，充分水洗。酒精脱水，二甲苯透明，封片。镜下观察胞浆着色呈棕黄色者为阳性。2.5F022对脂多糖诱导鼠体内TNF，IL6和N的抑制作用2.5.1血清样品制备按2.4.1的方法分组给药，9h后，乙醚麻醉，眼眶内取血，静置后取血清，-20贮存备用。2.5.2TNF和IL6检测按2.2的方法检测并计算抑制率。2.5.3N检测采

16、用Griess试剂法。取待测血清50l，参加等体积的Griess试剂，室温放置反响10in，应用酶联免疫检测仪在550n波长下测定样品的吸光度。3结果3.1F022对内毒素的破坏作用1%F022液对内毒素的破坏率为86.5%。3.2F022对LPS处理巨噬细胞分泌TNF和IL6的影响结果说明，F022能抑制巨噬细胞分泌TNF和IL6；抑制率分别为69.70%，83.60%。结果见表1。表1F022对LPS致鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF和IL6的影响略3.3F022对LPS诱导鼠蛋白激酶APKp38的影响药物组的APKp38活性与阴性对照组比拟差异无显著性，而单纯LPS组，APKp38活性升高明显，

17、差异有极显著性意义(P0.01)。结果见表2。表2F022对LPS诱导鼠蛋白激酶APKp38的影响略3.4F022对脂多糖刺激鼠组织esinRNA表达的影响图像分析采用北航医学图像处理系统给予原位杂交显色强度计分。计量资料用t检验，计数资料用2检验。结果见表3。由表3可见，SA可抑制LPS刺激小鼠组织esinRNA表达，且在不同组织有明显差异，肝和肾内表达强于脾脏。表3F022对脂多糖刺激鼠组织esinRNA表达的影响略3.5F022对LPS诱导鼠体内TNF，IL6和N的抑制作用小鼠经不同浓度F022部位处理后再给予同等剂量LPS，其血清中TNF、IL6和N浓度及抑制百分率见表4。由表可见，板

18、蓝根有效部位对LPS刺激小鼠体内释放TNF，IL6和N有抑制作用。表4F022对LPS诱导鼠体内TNF，IL6和N的抑制作用略4讨论细菌内毒素与靶细胞互相作用可表现出广泛的生物学活性，从分子程度上看，该作用主要通过内毒素和其受体之间特异性结合来介导，LPS与受体结合后，通过G蛋白偶联，激活蛋白激酶，完成信号跨膜转导，激活单核巨噬细胞，促进TNF，IL6，N等炎性因子的释放。我们前期研究证明35，板蓝根F022能直接中和LPS，破坏其超微构造。本文对F022部位的内毒素破坏作用了定量研究，发现1%F022液对内毒素破坏到达86.5%，在内毒素致病的信号传导过程中，内毒素受体起了关键性作用。目前，

19、已发现的内毒素受体主要有D14、膜构造伸展刺突蛋白(esin)、钟声类蛋白、低密度脂蛋白等，其中与致病关系亲密的是D14，esin和钟声类蛋白。国外有研究说明，应用esin单克隆抗体可阻止LPS的生物效应达90%以上，而D14的抗体却只能拮抗LPS生物效应50左右8。因此，本课题选择esin作为内毒素受体的检测对象，结果显示，按800ng20g1LPS刺激后小鼠9h后的肝、肾、脾内esinRNA表达较明显，其计分值与对照组比拟，差异有极显著性。而预先给予1%F022液的小鼠，其计分均较LPS组低，可见板蓝根可影响LPS刺激的esinRNA的分子表达程度。APKp38激活是胞内信号传导很重要的环

20、节，通过激活APKp38，启动效应分子如肿瘤坏死因子TNF，IL6，N等的基因表达和产生，由此导致一系列的病理生理反响9。从板蓝根对抑制LPS诱导的蛋白激酶APKp38活性实验结果可见，LPS对F022液的预处理的巨噬细胞APKp38活性未见明显增强，体内外TNF、IL6、N程度无明显上升，与单独参加LPS后这些指标显著增高相比，差异有极显著性意义(P001)。可见板蓝根可特异性抑制由LPS介导的APKp38活性。参考文献：1黄爱明，苏东辉内毒素休克防治进展J.国外医学微生物分册，1996，19(6):15.2刘云海板蓝根注射液抗内毒素作用的实验研究J.中草药，1993，24(8):4133uXY，LiuYH，ShengY，etalheialnstitutinfIsatisIndigtiaJ.Plantaedia,1997,63：55.4刘云海，林爱华，丁程度，等板蓝根氯仿提取物及其4组份抗内毒素作用