枸杞基因组DNA提取及指纹图谱分析

1、枸杞基因组DNA提取及指纹图谱分析【关键词】枸杞；,基因组DNA；,RAPD；,指纹图谱摘要：目的建立一种适于RAPD分析的快速提取枸杞叶片基因组DNA的方法，并利用RAPD技术研究枸杞属植物基因组DNA指纹图谱。方法采用改良的TAB法提取枸杞冷藏幼叶的基因组DNA，利用RAPD技术对其进展指纹图谱分析。结果改良的TAB法提取的10份枸杞材料基因组DNA均适于RAPD分析；可提供明晰的RAPD指纹图谱，利用挑选出的2个随机引物对供试材料DNA进展随机扩增，共得到56条带，其中多态性条带44条，多态性百分率为78.6%。结论说明改良的TAB法提取的枸杞基因组DNA不需经氯化铯梯度离心或柱层析纯化

2、，可以直接用于RAPD分析；RAPD对枸杞属植物进展指纹图谱分析是可行的。关键词：枸杞；基因组DNA；RAPD；指纹图谱ExtratinfGeniDNAfrLyiubararuandItsFingerprintAnalysisAbstrat：bjetiveTdevelpvalidethdtextratDNAfrLyiubararufrRAPDanalysisandresearhitsDNAfingerprintbyusingRAPDtehnlgy.ethdsTheextratsfhighqualitygeniDNAasextratedfrthefrzenleavesfLyiubararubyd

3、ifiedTABethdanditsfingerprintasanalyzedbyRAPD.ResultsThelearfingerprintsftheextratsfgeniDNAuldbegtbyRAPD.TRAPDpriersereappliedtdrandaplifiatin.Attalf56DNAbandsasdeteted,44anghihereplyrphi,theaverageratefplyrphibandsas78.6%.nlusinThedifiedTABethdasvalid,quikanddidntneedphenlextratin.ThisislatedDNAuld

4、beuseddiretlyfrRAPDanalysisithutsedientatininesiuhlridegradientrlunhratgraphy.TheRAPDarkersanbeusedfrthestudiesffingerprintfLyiubararusensitively.Keyrds：Lyiubararu;GeniDNA；RAPD；FingerprintRAPD由illias和elsh两个研究小组几乎同时于1990年建立起来的一项分子标记技术1,2，是目前中药研究者最常使用的DNA标记技术。RAPD标记所需样品基因组DNA的量仅为10ng，且RAPD引物已商品化消费。因此，

5、它可以在不知道特异DNA序列的情况下检测DNA的多态性，尤其在目前绝大多数动、植物中药材DNA序列尚不清楚的情况下，在中药品种研究方面RAPD标记比其它分子标记更具有广阔的应用前景3。虽然DNA分子标记技术在枸杞属植物鉴定等方面已有一些报道，张艳波等4搜集了6种枸杞属植物，其中2个正品，4个混淆品种，运用RAPD技术进展分析，获得了枸杞属不同种的特异性DNA指纹图谱，从而将它们准确区别。郑可大等5搜集了20个台北市场枸杞商品，运用RAPD技术进展分析，获得了2个DNA指纹图谱类型，推测其中15个是正品枸杞，5个混淆品。魏玉清等6对宁夏不同地区主栽枸杞品种利用RAPD技术进展了鉴别。但目前分子标

6、记用于枸杞属植物研究的种类和数量都非常有限，本实验所选的局部枸杞材料未见有RAPD研究报道。获得高质量的DNA样品是进展RAPD分析的首要步骤。目前，有许多植物基因组DNA提取方法79。要用于RAPD分析，DNA提取步骤越少越好，能减少对DNA的破坏；多步骤、多种试剂容易引起DNA的破坏和污染，从而影响PR反响及PR扩增产物的结果分析。关于从枸杞果实中提取基因组DNA有一些报道4,510,11，而有关从枸杞叶片中进展基因组DNA提取与PR分析的详细研究尚未见报道。枸杞(Lyiubararu)叶内多糖等物质含量较高，这些次生物质与DNA形成复合物，这种DNA不能用于PR扩增。为理解决这个问题，最

7、理想的方法是用氯化铯梯度离心或柱层析纯化DNA，但此法昂贵、费时，且需大量试材。本研究力图通过实验建立一种简易的提取枸杞叶片基因组DNA的方法，并对其进展RAPD鉴定，从而在此根底上进展RAPD指纹图谱分析。1材料与方法1.1材料实验所用的10份材料及来源见表1野生枸杞为野外获得的一棵外形不同于宁夏主栽品种的植株。表1材料名称略1.2仪器与试剂PR仪PT200TPeltierTheralyler，JResearh，In，USA；电泳仪DYY10型；北京六一仪器厂；电泳槽DYp31型；北京六一仪器厂；SartSpeT3000核酸蛋白测定仪BIRADLab，In，USA；Eppendrf5415D

8、离心机；UVPGDS8000凝胶成像系统。Buffer，TaqDNA聚合酶，dNTPs，gl2，300bpDNAladder购自北京天为时代公司，10碱基随机引物购自上海生工生物工程，AgarsePrega公司，EB瑞士Flukaheika公司。1.3方法1.3.1基因组DNA提取采用TAB法1215，并适当改良。详细步骤为：枸杞幼叶在液氮中研磨至无可见组织块后装入1.5l的Eppendrf管中大约1/3体积，参加500l提取缓冲液含100l/LTrisHlpH8.0，20l/LEDTA,1.4l/LNal，2%TAB，0.2%巯基乙醇，混匀，65温育30in，取出立即放入冰中冷冻10in。参

9、加500l的氯仿异戊醇241，混匀，于4冰箱中冷冻10in，12000r/in离心10in，转移上清液于干净的1.5l的Eppendrf管中，重复1次。参加300500l的异丙醇或1l的无水乙醇混合，于-20下静置20in。12000r/in离心15in，弃上清液，先参加70%乙醇洗沉淀两次去除有机溶剂、无机盐等，然后参加无水乙醇脱水，室温枯燥。将枯燥DNA溶解于200l的ddH2或TE缓冲液含10l/LTrisHl，1l/LEDTA，pH8.3做母液于-20储存。将DNA母液取出10l稀释40倍后，用SartSpeT3000核酸蛋白测定仪测波长260，280及320n处光吸收，直接从仪器主屏

10、上读出被测样品A260，A280，A260/A280和DNA含量。点6上样缓冲液10l于玻璃板上，分别汲取各材料DNA母液2l与其混匀，然后在0.8%琼脂糖凝胶上电泳72v电压下电泳30in，检验DNA片段大校最后将DNA母液稀释为20ng/l的工作液分装成小包装于-20储存或4保存备用。1.3.2PR扩增及电泳检测反响在PT200型PR仪上进展。采用本实验室长期使用的20l反响体系，其成分为：10Buffer不含g2+加0.8l25lL-1g2+，1l2.5dNTPs，1UTaqDNA聚合酶，1l0.37510碱基随机引物，50ng模板。反响程序：预变性942in；预扩增程序：9420s，3

11、630s，721in，5个循环；扩增程序：9420s，4030s，721in，40个循环；然后72延伸10in，最后4保存。扩增产物经含有0.5g/lEB的1.4%琼脂糖凝胶电泳别离72v电压下电泳45in，电泳完毕后在UVPGDS8000凝胶成像系统上观察照相。1.3.3RAPD随机引物挑选用一种材料做完20个引物后，去除只扩增出3条带以下或没有条带的引物，再用另一种材料依次挑选下去。挑选出多态性较强、重现性好的引物2个S331：5TAGTGA3和S2063：5GAGGAA3。2结果2.1改良的TAB法成功提取了枸杞叶片基因组DNA本实验在参考TAB法根底上适当改良，成功提取了枸杞基因组DN

12、A，该方法不需饱和酚抽提、氯化铯梯度离心和柱层析纯化，可直接用于RAPD分析。2.2枸杞基因组DNA质量检测采用改良的TAB法所提枸杞的DNA颜色为透明的白色、干后无色。点样孔110分别对应110号供试材料图1枸杞基因组DNA电泳图略由图1可看出，枸杞基因组DNA经电泳检测在点样孔附近呈一条亮且集中的条带，说明DNA未降解；亮带前面的条带经RNase处理后不再存在，说明这些条带为RNA。表2基因组DNA纯度及含量检测略由表2可看出，波长260n和280n光吸收比值在2.082.53之间，DNA含量在7122870g/l之间。2.3模板浓度对扩增结果的影响我们实验室长期使用50ng/20l体系的

13、模板DNA浓度，RAPD标记所需样品基因组DNA的量仅为10ng3，于是我们设计了10ng/20l体系、20ng/20l体系、50ng/20l体系3个模板浓度对扩增结果的影响。本实验用了1个挑选过的随机引物S1：5GTTTGT3S3：5对3种材种2号宁杞1号、4号血杞1号和5号精杞1号材料进展浓度梯度试验。由图2可知，反响体系中模板DNA浓度为1050ng/20l体系时扩增结果没有明显区别；由于实验室习惯，我们选用了50ng/20l体系的模板DNA浓度。转贴于论文联盟.ll.图2不同模板DNA浓度扩增结果略2.4枸杞基因组DNA指纹图谱分析2.4.1挑选的2个随机引物对10份材料基因组DNA的

14、扩增由于RAPD随机引物10个碱基太短，而且退火温度较低3640，很容易造成错误配对，再加上各种试剂的质量和浓度差异，造成扩增出现假阳性带型和结果的不稳定。因此，在本实验利用RAPD技术时，笔者首先对实验室长期使用的反响体系进展了优化，然后以10份供试材料的DNA为模板，运用挑选出的2个RAPD引物分别扩增，扩增结果如图34所示，扩增出的DNA带的分子大小在5002500bp之间；2个引物扩增的条带数量以及区分10份供试材料6类，野生枸杞不计入的区分率均存在差异，2个引物扩增6类材料的条带数量分别为23条和33条，平均每个引物扩增28条带；扩增的具有多态性的条带分别为17条和27条，平均每个引

15、物扩增22条具有多态性的带，其统计分析结果如表3所示，从表3统计结果可知，区分6类供试材料的区分率分别83.3%S331不能区分2和3和66.7%S2063不能区分2和3及4和9，平均为75%。两个引物共扩增出56条明晰条带，其中44条具有多态性，多态性比率PPB达78.6%。2.4.2指纹图谱解析由图3、图4和表3可知，运用挑选出的S331和S2063两个引物仅不能区分2和3宁杞1号和宁杞2号。虽然引物S331扩增的条带数量和具有多态性的条带数量均比S2063的少，但引物S331扩增条带的明晰度比S2063的要好，且区分6类供试材料的区分率比S2063的高，扩增出现假阳性带型和结果不稳定性的

16、机率大大减少，综合各种结果可看出，引物S331比S2063的扩增效果要好。从图34可知，2，6，7和8不同地方的宁杞1号指纹图谱一致，2和3仅在S331扩增出的500bp处共有带的亮度不同，不能有效地进展区分，其它种类可以有效地进展区分，说明RAPD技术用于不同品种枸杞的鉴别是有效的。：300bpDNAladder2500，2000，1500，1000，500，300K：阴性对照不加模板DNA点样孔110分别对应110号供试材料图3引物S331扩增10份DNA样品的结果略：300bpDNAladder2500，2000，1500，1000，500，300K：阴性对照不加模板DNA点样孔110分

17、别对应110号供试材料图4引物S2063扩增10份DNA样品的结果略表3扩增谱带情况分析略3讨论3.1植物药中的小分子次生代谢产物如萜类、黄酮、香豆素、有机酸、鞣质等含有酚羟基的化合物，氧化后易与DNA结合，引起DNA降解或抑制酶的活性，而植物中存在的多糖类由于与DNA同属大分子化合物，一般提取过程很难去除干净，也可能影响DNA的进一步酶处理或PR扩增16。采用改良的TAB法对枸杞幼叶基因组DNA进展提取，经电泳检测，紫外吸收检测及RAPD分析发现，改良后的TAB法合适枸杞幼叶基因组DNA提龋采用该法提取的基因组DNA枯燥时呈透明的白色，溶于水或缓冲液中无色，说明TAB除色素及次生代谢物效果好

18、。TAB是一种去污剂，既能裂解细胞又能有效地沉淀次生代谢物，特别是多糖。由于提取过程未用RNase处理，10份材料基因组DNA的A260/A280均大于2.00，但对上述10份材料DNA样品进展RAPD分析，能获得好的结果图24。由实验结果可见，枸杞RAPD分析所用的DNA，无需复杂的纯化过程，只需简单的氯仿异戊醇241抽提，并且不需去除RNA，但研磨要充分。可见，采用改良TAB法提取枸杞幼叶基因组DNA，步骤简单，合适进展RAPD分析用，防止了使用苯酚这种有毒试剂。3.2RAPD技术本身存在多态性少和重现性的缺点17，对此缺点笔者在实验设计的时候就已经考虑到了。挑选引物时笔者用了3种枸杞材料

19、，选出在3种枸杞材料中均有3条以上条带、并且重复23次均能扩增出一样结果的引物进展扩增。选出的引物在一定程度上可以作为枸杞属植物的通用引物，本实验根本上证实了这一点。考虑到枸杞变异较大，中间类型很多，种的界限不清楚，对有些种和品种的形态学分类操作者存在着客观和主观的原因等因素，本实验所用候选引物的数量还不够多，可以再增加，这在一定程度上可以减少实验结果分析的误差，以及种和品种间遗传多样性所产生的影响。3.3随着分子标记技术的开展，各种新的标记技术不断产生，假如要科学、准确地对植物的基因组DNA进展指纹图谱分析，进而对植物的遗传多样性和亲缘关系进展研究还得运用多种分子标记技术，将每一种标记的结果

20、和传统的分类结果进展全面的比拟和分析才能获得令人信服的结果。但由于对枸杞属植物的遗传背景理解不多，运用RAPD技术对其基因组DNA进展指纹图谱分析从而进展道地品种的鉴别、遗传多样性及亲缘关系的研究是目前最有效的方法。3.41野生枸杞和2，6，7，8不同地方的宁杞1号指纹图谱一致，说明野生枸杞可能是宁杞1号，其植株外形不同于宁夏栽培的宁杞1号可能是受环境的影响发生了形态变异。参考文献：1illiasJG,KubelikAR,LivakKJ,etal.DNAplyrphissaplifiedbyarbitrarypriersareusefulasgenetiakersJ.NulEiAidsRes,

21、1990,25(18)：6531.2elshJ,lelland.FingerprintinggenesusingPRitharbitrarypriersJ.NulEIAidsRes,1990,25(18)：7213.3曹晖，刘玉萍.分子标记技术在中药品种鉴别中的应用J.中国药学杂志,1998，335：269.4ZhangKYB,LeungH,YeungH,etal.DifferentiatinfLyiubararufritsrelatedLyiuspeiesusingrandaplifiedplyrphiDNAJ.Plantaed,2001,67：379.5hengKT,hangH,HuangH,etal.RAPDanalysisfLyiubararuediineinTaianarketJ.BtBullAadSin,2000,41：11.6魏玉清，许兴，王掌军等.宁夏不同地区主要栽培枸杞的RAPD分析J.西北农林科技大学学报自然科学版，2022，181：60.7王培训,周联,赖小平.分子生物学技术与中药鉴别RAPD技术的研究与应用.广州：广东世界图书出版，2002：94.8周延清.DNA分子标记技术在植物研究中的应用.北京：化学工业出版社，2022：1