表达载体的构建方法及步骤

1、令狐采学创作令狐采学创作表达载体的构建方法及步骤令狐采学一、载体的选择及如何阅读质粒图谱NA 新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素：复制起始位点(加即控制复制起始的位点。原核生物NA分子中只有一个复制起始点。而NA分子有多个复制起始位点。Amp+,Ian+MCS克隆携带外源基因片段P/E启动子/增强子Terms终止信号poly(A)mRNA作用限制酶切位点。如果构建的目3点：1NA重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合 适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型：令狐采学创作克隆载体的克隆能力一据克隆片段大小(大选大，小选小)。如n)kb 选质粒。表达载体据受体细胞类型一原核/真核/

2、细胞表达载体。关于原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服 4个困难和阅读框错位表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3】载体 MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异适应目的基因与载体易于链接，不能产主阅读框架错位。综上所述，选用质粒(最常用)做载体的 5 点要求：选分子量小的质粒，即小载体(l-1.5kb) 一不易损坏， 在细菌里面拷贝数也多(也有大载体)；1()上的拷贝，而严谨型质粒1()个。必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；位 Ampr(试一试)。满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋

3、白，是否需要真核抗性(如Pur。、 G418)等等。无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体 NA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与令狐采学创作目的基因片段进行连接。如何阅读质粒图谱第一步：首先看的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿 梭质粒）第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什次筛选 标记。Ampr水解卩一内酰胺环，解除氨节的毒性。tetr可以阻止四环素进入细胞。camr生成氯霉素轻乙酰基衍生物，使之失去毒性。neor（kanr）G418（生 物）失活hygr使潮霉素卩失活。O第三步：看多克隆位点（MCS） 它具有多个限制酶的单一切点。 便于外源基因的插入。

4、如果在这些酶切位点以外有外源基因的 插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能 放目的基因以及如何放置目的基因。ONA插入片段大小。质粒一般只能容纳小 于l（）KbNANA第五步：是否含有表达系统元件，即启动子一核糖体接合位点体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。第六步：启动子一核糖体接合位点一克隆位点一转录终止信号令狐采学创作NANANANA 分子上可以与RNApol转录。增强子/沉默子一为真核基因组(囊括真核病毒基因组) 中的一种具有增强邻近基因转录进程的调控顺序。其作用与增 强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可 发挥作用。/沉默子一负增强子，负调控序列。

5、(3)核糖体接合 位点/起始密码/S序列(Rbs/AGU/Ss):mRNAAUG S(4)转录终止序列(终止子)/翻译终止密码子：结构基因的 最后AATAAAown streamGTT2poly(A)AATAAA 的 保守序列own-streamGTT2部分共通构poly (A)加尾信号。质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两 NANA,它的启动子等在其中一 条链上，而它的抗性基因在另一条链上.根据表达宿主不同， 构建时所选择的载体也会不同。二、目的基因的获得 一般来说，目的基因的获得有三种途径： 调取基因：根据目的基因的序列， 设计引物从含有目的基因的令狐采学创作CNA PC

6、R 的方法调取目的基因，克隆进行测序，以获得想要的基因片段，这种方法相关于成本 较低，但是调取到的基因往往含有突变，还有不同基因的表达 丰度不同，转录本比较复杂，或是基因片段很长，这些情况都 很难调取到目的基因。C全基因合成：根据目的基因的 NA 序列，直接设计合成目的 基因。此方法准确性高，相关于成本会高一些，个人操作比较困难，需要专业的合成公司完成。优点是可以合成难调取及人工改造的任何基因序列，同时可以进行密码子优化，提高目的基因在宿主内的表达量。三、克隆构建目前，克隆构建的方法多种多样，除了应用广泛的酶切链接以外，现在还有很多不依赖酶切位点的克隆构建方式。下面具体说一下双酶切方法构建载体

7、的步骤。实验材料实验试剂试剂名称载体 pCNA3.1H5a限制性内切酶T4 连接酶生产厂家Transheep Tiangen Fermentas Fermentas质粒 NA 小，大疑抽提试剂盒 Axygen凝胶回收试剂盒Axygen琼脂糖NA laerBiowestFermentas(2) X基因慢病毒载体的构建XTranshecpPUC57中。PUC57-XEcoRl/BamHI酶切完成后进行胶回收2.pCNA3.1双酶切，酶切体系如下。20ul373小时4ulpCNA3.1载体(5()()ng/ul) lulBamHI1 ulEcoRI2ul1()X12 ulH2()酶切完成后胶回收(见附录)处理好的目的片段与载体连接反映体系：6ul PCR 50ng/ul) lul50ng/ul)2ul ligaselul T41igase l()ul H2()16C过夜。转化(感受态细胞:H50,具体步骤见附录转化部分。令狐采学