盐酸槐定碱注射液对DNA拓扑异构酶活性抑制作用的研究

1、盐酸槐定碱注射液对DNA拓扑异构酶活性抑制作用的研究【关键词】盐酸槐定碱,；,拓扑异构酶；,活性作用摘要：目的研究盐酸槐定碱对DNA拓扑异构酶I和酶IITPI、II活性的影响。方法DNA超螺旋解旋法检测盐酸槐定碱注射液对拓扑异构酶I及酶II介导的PBR322DNA解旋反响的影响。结果盐酸槐定碱注射液能明显抑制TPI介导的DNA解旋及断裂，在终浓度为6250g/l和3215g/l时对拓扑异构酶I均有抑制作用，且剂量-效应关系亲密，但对拓扑异构酶II介导的DNA解旋反响无影响。结论结果提示盐酸槐定碱注射液的直接作用靶点是DNA拓扑异构酶I，该药为拓扑异构酶I抑制剂。关键词：盐酸槐定碱；拓扑异构酶；

2、活性作用Abstrat：bjetiveThepurpsefthisstudyastinvestigatethepriniplefativityfprtingDNAtpiserase.ethdsTheeffetfSphridinehydrhlriuntpiseraseaseasuredbysuperiledDNArelaxatinassay.ResultsSphridinehydrhlriuuldarkedlyinhibittheativityftpiseraseI,by6250g/land3215g/lrespetively,uldntprvethatitinhibitedtheativity

3、ftpiseraseII.nlusinItaybethefatthatDNAtpiseraseIisadirettargetinantiturativityfSphridinehydrhlriu.Keyrds：Sphridinehydrhlriu;DNAtpiserase;antiturativity癌症是严重威胁人类安康的一类疾病，寻找有效的抗癌药物是目前世界医学界重要的研究课题，由于合成药物在伴随治疗中出现明显的副作用，天然药物越来越受到人们的重视和青睐。盐酸槐定碱是一种植物来源的天然药物，在槐树的果实中含量很高。盐酸槐定碱注射液主治癌症，疗效确切，毒副作用极低。为进一步讨论该药物的作用机

4、理，我们以DNA拓扑异构酶I、II为靶点，体外测定盐酸槐定碱注射液对其活性的影响，以便为临床治疗肿瘤提供更多的根据。结果报道如下。1材料和方法1.1材料1.1.1药物盐酸槐定碱注射液由江西中医学院提供。1.1.2试剂PBR322DNA、溴化乙锭EB及二甲苯青FF均系Siga公司产品。DNA拓扑异构酶I试剂盒购自大连保生工程，DNA拓扑异构酶II系美国USB产品，琼脂糖系GIB产品，羟基喜树碱购自黄石飞云制药，鬼臼乙义苷VP-16购自江苏恒瑞医药股份。1.2方法1.2.1拓扑异构酶I活性的测定在20l的反响体系中含有10反响缓冲液350l/LTris-HlpH8.0l/L,720l/L氯化钾，5

5、l/L氯化镁，50l/LDTT,50l/LSperidine2l,0.1%BAS2l，PBR3220.36g,阳性对照管羟基喜树碱终浓度为212.5g/l，10.6g/l。各试管分别参加不同浓度的槐定碱终浓度分别为6250，3215，625g/l。拓扑异构酶I，各管用蒸馏水补充至20l，混匀后置37反响30in，参加5l终止液5%的SDD,40%的蔗糖，0.25g/l溴酚兰终止反响。在TBE电泳缓冲液中进展琼脂糖电泳，40V电压下，电泳4h。溴化乙啶溶液1g/l染色30in,置260n紫外线下观察DNA的电泳区带，并摄片记录。1.2.2拓扑异构酶II活性的测定参照TPII试剂盒实验方法,20l

6、的反响体系中含有10 x反响缓冲液100l/LTris-Hl,pH7.9l/L,500l/L氯化钠，500l/L氯化钾，50l/L氯化镁,1l/LEDTA,0.15g/lBSA,10l/LATP2l,PBR322DNA0.3g,阳性对照管鬼臼乙义苷VP-165000，1000，500g/l。各试管分别参加不同浓度的槐定碱:6250，3215，625g/l。储藏酶用酶稀释液10l/L磷酸钠pH7.1,50l/L氯化钠，0.2l/LDTT,0.1l/LEDTA,0.5g/lBSA,10%的甘油稀释至1g/l,参加1l。各管用蒸馏水补充至20l，在30反响15in，参加3l终止液7l/LEDTA,0

7、.77%SDS,20%甘油，0.25g/l溴酚兰终止反响。电泳、染色及观察过程同1.2.1。2结果2.1盐酸槐定碱注射液对TPI活性的影响结果见图1。由图1可见阳性对照药羟基喜树碱在212.5和10.6g/l时对TP酶I均有显著的抑制作用,D道。盐酸槐定碱具有一定的抑制TP酶I的的作用，6250g/l剂量组对TP酶I有较好的抑制作用,抑制该酶介导的DNA断裂反响，3215g/l剂量组作用稍差，剂量降至625g/l抑制作用不明显，剂量效应关系亲密E,F,G道。2.2盐酸槐定碱注射液对TPII活性的影响由图2可见,随着盐酸槐定碱浓度的增加6250，3215，625g/l，超螺旋DNA均无明显变化，

8、说明盐酸槐定碱注射液对TPII的活性没有影响,D,E道。阳性对照药VP-16在5000，1000及500g/lF,G,H道三个浓度均能显著抑制TPII酶的活性，量效关系明显。3讨论DAN拓扑异构酶是近年发现的维持DNA复制、重组、转录等信息传递及加工的重要空间构型酶，其催化单链或双链DNA短暂别离，以利于复制，按其诱导DNA断裂机制的不同，分为TPI和TPII。由于DNA超螺旋程度影响着机体的活动，而拓扑异构酶的作用正是控制DNA的空间构型酶，由此该酶被列为挑选抗肿瘤药物的重要靶酶14。用DNA拓扑异构酶I和II介导DNA断裂实验观察盐酸槐定碱注射液对DNA作用的方式，这是目前较快速、敏感的体

9、外肿瘤药物挑选方法。转贴于论文联盟.ll.本实验研究了不同条件下盐酸槐定碱注射液对拓扑异构酶I及酶II的影响，结果显示，盐酸槐定碱注射液能明显抑制TPI的活性，抑制其介导的DNA解旋或断裂，随着浓度的进步，这种作用愈趋明显，并呈现较好的量效关系，但其对TPII的活性几无影响，因此我们推测盐酸槐定碱注射液的细胞毒活性可能与其抑制TPI活性有关，TPI是其抗肿瘤作用的细胞内靶点之一。一般认为，药物对酶介导的DNA断裂反响的影响有促进或抑制两种类型5，盐酸槐定碱注射液属于后种，即该药可以抑制肿瘤细胞内拓扑异构酶I的活性，通过抑制该酶介导的DNA裂解反响发挥其抗癌作用。迄今为止，世界上进展过抗癌活性挑

10、选研究的化合物已超过50万种，从中寻找出不少有临床应用价值的药物，批准上市的约有70种，这些药物中有相当一局部是基于抑制DNA拓扑异构酶的作用而产生抗癌活性的，目前，TPI抑制剂主要为喜树碱及其衍生物，近年来还开展了拓扑特肯TPT、依林特肯PT-11两个喜树碱类药物，TPII抑制剂主要有阿霉素、柔红霉素、VP-16等，蒽类氨基酸偶合物等那么可同时抑制TPI和II，在这些药物中有些因不良反响大、水溶性低等原因，其临床应用一直受限制，如喜树碱等。因此寻找高效低毒的DNA拓扑异构酶I抑制剂具有重要的现实意义78。盐酸槐定碱注射液是从中草药中提取的单体生物碱中医一类新药，动物实验已证实其对EA等动物肿

11、瘤有显著的抗癌作用6，临床试验也证明该药对恶性滋养叶癌恶葡和绒癌等癌症有明显的疗效，并且毒副作用极低，同时，我们的实验也证实盐酸槐定碱注射液的直接作用靶点是DNA拓扑异构酶I，因此该药是一类很有前途的天然植物抗癌药。参考文献：1RasheedZA,RubiEH.ehanissfresistanettpiserasel-targetingdrugJ.ngene,2022,22:7296.2angHK,rris-NatshkeSL,LeeKH.Reentadvanesinthedisveryanddevelpentftpiseraseinhibitrsasantituragents.J.edResRev,199717(4):3673张利萍，蒋记恺，刘祥贵.DNA拓扑异构酶及其抑制剂与细胞凋亡J.国外医学临床生物化学与检验学分册，1997，1810：504angJ,DNAtpiserases.AnnuRevBihen,1996,355(1,2):915刘晓梅，王龙贵，籍秀娟，等.以DNA拓扑异构酶为靶点的一种抗癌药物挑选的新方法J.癌症，1991，35：2206李雪梅，吴运光，陈绍励，等.槐定碱的抗癌作用J.中国药理学报，1987，82：1537SinhaBK.T