细胞实验设计

1、原生质体的分离培养与融合一、实验目的1、了解植物原生质体分离、融合基本原理。2、了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。二、实验原理植物原生质体最方便的来源是叶片，因为叶片中可以分离出大量 的比较均一的细胞，而又不致使植物遭到致命的破坏。由于叶肉细胞 排列疏松，酶的作用很容易达到细胞壁。其中酶解法分离原生质体是 一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果 胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成 分，除去细胞壁。许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广 泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法。PEG为一种高分子化合物，能

2、与水、蛋白质、和碳水化合物等一 些基团能形成氢键。普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结 构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细 胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而 使细胞发生融合。三、实验用品材料植物叶片(菠菜叶片)仪器倒置显微镜，离心机，过滤筛（100日），漏斗，烧杯，吸管，长注 射针，注射器（510ml）三角瓶、离心管、解剖刀、长、短镊子、 培养皿、滤纸。试剂纤维素酶2%，果胶酶1% （在0.65mol甘露醇，0.05M氯化钙和0.1%MES 中，pH 调至5.66.0），0.16M 氯化钙溶液（内含0.1%MES）Ph5.6, 22%蔗糖溶

3、液，30%聚乙二醇（PEG）溶液，高pH高钙洗脱液（Ph=9）: 0.1M 氯化钙、0.1M 梨酶醇、0.5ml/100ml 1molTris，0.24M 氯化钙四、实验过程（一）原生质体的分离收集取菠菜叶片撕去下表皮，称0.2g,切成小块放到10ml酶液中， 在26C下酶解45小时，或含酶量减半过夜，期间轻轻摇动几次。用100日的过滤筛过滤。用与滤液等体积的0.16mol氯化钙溶液冲洗过滤筛，使冲洗液 冲入过滤液。滤液用离心机100300rpm，离心5分钟，弃上清液。沉淀中加入0.16mol氯化钙溶液12ml于沉淀，轻摇使之悬 浮，用带长针头的注射器自离心管底部轻轻地加入68ml 22%蔗糖

4、溶 液，使之形成界面。静置待原生质体形成一条带时弃去上、下液及残渣，用吸管收 集原生质体。用.0.24Mmol氯化钙溶液洗涤一次，离心吸取上清液。沉淀中加入12ml.0.16mol氯化钙溶液悬于沉淀，用血球计 数板计数，使原生质体密度为200000个/ml。取一滴于载玻片上，低倍镜观察原生质体的纯度和完整性，也 可用荧光显微镜检查。（二）原生质体的培养1原生质体培养基配方无机盐：大量元素浓度；NO -和NH+的比例；Ca2+浓度34有机成分：维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。激素：NAA、IAA、BA 与2,4-D渗透压：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。原生质体的渗透压原则：

5、培养基渗透压与细胞渗透压等渗2原生质体培养方法1）液体浅层培养将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进行 培养。优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培 养基和转移培养物。缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连 现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个 细胞的发育情况。2）液体一固体双层培养在培养皿的底部铺一层琼脂糖固体培养基，再将原生质体悬 浮液滴于固体培养基表面。优点：固体培养基中的营养物质可缓慢释放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中加一定量的活性炭，则还可以吸附培养 物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。缺点：不

6、易观察细胞的发育过程3）固体平板培养即琼脂糖包埋培养。低融点的琼脂糖可在约30C融化与原 生质体混合而不影响原生质体的生命活动。混合后含有原生质体 的培养基铺于培养皿底部，封口后进行培养。优点：可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于统计原 生质体分裂频率。缺点：操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握必需合适， 温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏低则琼脂糖凝固太快原 生质体不易混合均匀。4）琼脂糖珠培养将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50ul 一滴的 量滴于直径6cm的培养皿，待其固化后向其中添加3ml液体培养 基并于摇床上低速旋转培养。培养过程中，通过调整液体培养基 的渗透压来调

7、节培养物的渗透压以利于其进一步的生长和发育。 这种方法由于改善了培养物的通气和营养环境，从而促进了原生 质体的分裂和细胞团的形成。（三）原生质体融合操作如下图操作1.取上述原生质体液两滴，间隔5mm滴于载玻片上，静置10分钟，使原生质体沉淀在载玻片上。2.在两滴悬液之间加一滴30%聚乙二醇（PEG）溶液，使3滴溶液 相连，室温下（15C20C）。作用510分钟，在显微镜下观察原生 质体粘连情况。五、实验记录两细胞融合现象通常分为五个阶段：两细胞膜接触，粘连； 细胞膜形成穿孔；两细胞的细胞质连通；通道扩大，两细胞连成 一体；细胞完全合并，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。六、实验结果用光学显微

8、镜观察2-3个细胞靠近或融合的过程。（观察时注意不同 程度的融合现象。通常分为五个阶段。两细胞膜接触，粘连；细 胞膜形成穿孔；两细胞的细胞质连通；通道扩大，两细胞连成一 体；细胞完全合并，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。）七、实验结论用聚乙二醇作为诱导剂的情况下，两个植物细胞能够融合，形成 一个含有两个或多个核的圆形细胞。参考文献邢朝斌，沈海龙，赵星宇，刘岩，黄剑，范少辉.刺五加幼叶原生 质体的分离法J.植物生理学通讯.2006(02)周海霞.灭火原生质体融合选育!-ALDC高产菌株(理学硕士学 位论文)河北大学，2004.曹新祥，韩小云.植物组织培养中的pH值J.杭州师范学院 学报(自然科学版).2003(01)李勇，邢辉，张金芳，王洪利,冀宪领，段祖安.桑树悬浮细胞生 长规律及其生理特性的研究J.蚕业科学.2007(01)郑重谊，谢达平，谭周进，等 影响微生物原生质体融合技术的 因素J.湖南农业科学，2006 (4)： 35-38$王彦文，黄艳红，路国兵,王军妮，牟志美.桑树叶片愈伤组织的 诱导及不定芽分化影响因素的研究J.蚕业科学.2006(02) 2003(02)刘伟强.桑树原生质体游离与培养J.中国蚕业.2006(02)方文娟，韩烈保，曾会明.植物细胞悬浮培养影响因子研究J. 生物技术通报.2005(05)张守英，阙国宁.晚松悬浮细胞系