微生物遗传育种的 第三章-菌种的分离筛选

1、第三章菌种的分离筛选1.菌种来源2.分离方法3.菌种保藏4.菌种复壮典型的微生物新种分离筛选过程调查研究并充分查阅资料设计试验全案确定丰样的生态环境确定特定的噌瑁条件设计试验全案确定丰样的生态环境确定特定的噌瑁条件是定性或半定量的快速检测方法原种斜面确定发醉的基本条件L初筛（快速检测或一菌株工摇瓶培养测定）复研（菌株5捶瓶）结令初步的工艺条件L再复CB柱忧菌株斜面t3-5菌株生产性能读暇毒性试验菌种鉴定第一节菌种来源1.向菌种保藏机构索取有关菌株，从中筛选所需菌株。国内主要菌种保藏机构：AS中国科学院微生物研究所CMCC中国医学细菌保藏管理中心CVCC一兽医微生物菌种保藏管理中心IA中国医学科

2、学院抗菌素研究所IANP华北制药厂抗菌素研究所ID中国医学科学院皮肤病防治研究所、CAMS中国医学科学院流行病学微生物研究所IFFI一轻工业部食品发酵工业科学研究所等。国外主要的菌种保藏机构ATCC美国标准菌种收藏所NIH美国国立卫生研究院NRRL美国农业部北方开发利用研究所CMI英联邦真菌研究所，CSH美国冷泉港实验室IAM日本东京大学应用微生物研究所，IFO日本大阪发酵研究所，KCC日本科研化学有限公司，NCTC英国国立标准菌种收藏所WB美国威斯康星大学细菌学系等。2.由自然界(土样、水、动植物体等)采集样品，从中进行分离筛选。不可培养微生物是指目前尚不能实现人工培养的微生物。原因可能为尚

3、不了解该类微生物的营养需求和生长需要的理化环境。目前人类认识和培养的微生物还不到其存在种类的1%。3.从发酵制品中分离目的菌株。如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶产生菌等。采样过程(一)从土壤中采样要考虑土壤的有机质含量和通气状况、酸碱度和植被状况、地理条件和季节条件。用采样铲采集5-25cm(北方干燥的土壤，采集10-30cm)土样10-258，装入事先准备好的塑料袋内扎好，并编号，记录采集地点、土壤质地、植被名称、采集时间等。土样采集后要尽快分离，否则可取3-4g撒到事先准备好的选择性培养基试管斜面，避免菌株因不能及时分离而死亡。根据微生物生理特点采样.根据微生物营养类

4、型采样(1)微生物的营养要求和代谢类型与其生长环境有很大的相关性森林土壤富含纤维素，可分离纤维素酶产生菌；肉类加工厂附近和饭店排水沟的污水、污泥中，能分离到蛋白酶和脂肪酶产生菌；面粉加工厂、糕点厂、酒厂及淀粉加工厂等，容易分离到产生淀粉酶和糖化酶的菌株；从果园土和腐烂的柑橘、草莓及山芋中，容易分离到果胶酶产生菌。(2)若要筛选代谢合成某种化合物的微生物，从大量使用、生产或处理这种化合物的工厂附近采集样品，容易得到满意的效果在油田附近的土壤中容易筛选到利用碳氢化合物为碳源的菌株；有人从含油污泥中筛选出能以20#机械润滑油为唯一碳源的3株石油降解菌株；曾从乙烯氯化物的工厂附近分离到以乙烯氯化物为唯

5、一碳源的分支杆菌。(3)不少微生物对碳源的利用是不完全专一的。如一些油田微生物也可利用一些糖类为碳源等。2.根据微生物的生理特性采样筛选高温酶产生菌，要到温度较高的地区，或温泉、火山爆发处及堆肥中采样；分离低温酶产生菌要到南北极、冰窖、深海等寒冷的地方采样；分离耐压菌要到海洋底部采样；分离耐高渗的酵母菌，要到甜果、蜜饯或甘蔗渣堆积处采样等。特殊环境下采样.局部环境的影响寒冷地区的温泉或堆肥中，也可分离到高温微生物；氧气充足的土层中，也能分离到兼性厌氧微生物。海洋独特的高盐度、高压力、低温及光照条件，使海洋微生物具备特殊的生理活性，相应也产生了一些不同于陆地来源的特殊产物。海洋表层多为好气异养菌

6、，底层由于有机质丰富，H2s含量高，厌气性腐败菌和硫酸盐还原菌较多，中间层多有紫硫菌。如前苏联学者发现，20-50%的海鞘、海参体内的微生物可产生具有细菌毒性和杀菌活性的化合物；日本发现深海鱼类肠道内的嗜压细菌，80%以上的菌株可产生EPA（二十碳五烯酸）和DHA（二十二碳五烯酸），最高产量可达36%和24%。具有特殊性质的微生物通常分布在一些特殊的环境中。有人从侵蚀木船的一种蠕虫肠道中分离到既能固氮又能降解纤维素的微生物。从考拉肠道分离到萜烯分解酶的产生菌。从美国得州中南部的一个岩洞中分离到嗜碱性的，能进行氨氧化和产生几丁质酶的微生物。.极端环境条件的影响生长在高温、低温、高酸、高碱、高盐、

7、高辐射强度等极端环境的微生物，具有不同于一般微生物的遗传特性、特殊结构和生理技能，在冶金、采矿及特殊酶制剂生产等方面有巨大的应用价值。2、富集及筛选培养富集培养是指在样品中目的微生物较少时，根据微生物的生理特点，设计选择性培养基，创造有利的生长条件，抑制其他微生物的生长繁殖，使目的微生物迅速生长繁殖，以利于分离纯化。一般控制微生物的碳、氮营养需求，pH、温度、氧气等理化环境条件需求。（一）控制培养基的营养成分.在分离能利用某种物质的微生物时,可在分离培养基中加入相应的底物作唯一的碳源或氮源,可富集能分解利用该类物质的微生物.如分离产生某种水解酶是微生物;又如分离耐高渗的酵母菌，要到含糖分高的花

8、蜜、糖质中取样，采用5%-6%麦芽汁、30%-40%葡萄糖，pH3-4的培养基，在20-25培养。.要根据微生物的种类选用相应的富集培养基。如淀粉琼脂培养基（可溶性淀粉4%，酵母膏0.5%，琼脂2%，pH6.5-7.0）通常用于丝状真菌的增殖。其中酵母膏的用量过多会刺激菌丝生长，不利于孢子的产生。.根据微生物对环境因子的耐受范围具有可塑性的特点，可通过连续（几个月）富集培养的方法分离降解高浓度污染物的环保菌。如要分离能降解高浓度苯胺、环己烷、双对氯苯基三氯乙烷（DDT）、甲基对硫磷（MP）等的微生物。采用鉴别培养基，通过水解圈或变色圈可进一步提高筛选效率。（二）控制培养条件.通过微生物对pH值

9、、温度、氧气等的特殊需求，控制培养条件，达到有效分离的目的。如分离厌氧菌，在厌氧条件下培养；分离细菌和放线菌，培养基pH要求偏碱（7.0-7.5）；分离霉菌和酵母菌，pH要求偏酸（4.5-6.0）；分离放线菌，样品溶液在40处理20分钟，刺激孢子萌发等。.筛选极端微生物时，可针对其特殊生理特性，设计适宜培养条件，达到富集的目的。如分离嗜酸微生物，将pH调到1.0-2.5；分离嗜冷菌，置15以下，甚至0培养；筛选产蛋白酶的低温菌时，海水样品先用无菌微孔滤膜（Q0.2um）过滤富集，加入到18液体培养基，15振荡培养24h,取1ml用无菌海水稀释，涂布于选择性平板上低温培养。（三）抑制不需要的微生

10、物通过高温、高压、加入抗生素等方法减少非目的微生物的数量，使目的微生物增殖。如：从土壤中分离芽孢杆菌时，可将土样加热到80保持10分钟或100保持5分钟，或在50%乙醇中浸泡1h处理。分离细菌时，往富集培养基中加入50U/ml制霉菌素或30U/ml多菌灵，可抑制霉菌、酵母菌生长；分离放线菌时，样品溶液加几滴10%的酚，培养基加青霉素（40U/ml）、链霉素或四环素（120U/ml）抑制细菌，以及丙酸钠10Ug/ml（抑制霉菌）；分离根霉、毛霉等霉菌时，加入0.1%去氧胆酸钠或山梨糖，防止孢子蔓延；分离链霉菌以外的放线菌时，先将土样干燥，再加热到100保持1h,减少细菌和链霉菌的数量；分离耐高浓

11、度酒精和高渗酵母菌时，可分别将样品在高浓度酒精和高浓度蔗糖中处理一段时间，杀死非目的微生物；重铬酸钾对土壤真菌、细菌有明显抑制作用，可用于选择分离放线菌；培养基中加入适量胆盐和十二烷基磺酸钠（0.05%），可抑制G+细菌生长，对G-细菌无作用；氟哌酸（5mg/L）+制霉菌素（50mg/L）+青霉素（0.8mg/L）可有效抑制细菌和真菌，不抑制放线菌生长。第二节分离纯化方法（一）好氧微生物的分离.稀释涂布法.划线分离法.组织分离法（包括组织分离法、基质分离法、多孢子分离法、单孢子分离法等），适用于病理组织、食用菌等真菌。.单细胞或单孢子分离法：采用单孢分离器，或小滴分离法、滤纸分离法等。小滴分离

12、法：将孢子悬浮液或菌悬液稀释用校正口径的滴管（每毫升4000滴）吸取悬液并均匀滴到无菌干燥盖片上小心翻转盖于凹玻片孔穴上，穴内加一滴灭菌培养液盖片和载片用凡士林密封。显微镜下观察每个小滴，将只有一个孢子或菌体的小滴做好记号恒温培养，挑取单菌落于斜面。滤纸分离法：取与培养皿内径大小一致的滤纸3-4层，浸在培养液中，取出放在空皿中，滤纸上滴加几滴甘油以防干燥，盖好皿盖，灭菌。稀释后的孢子悬液或菌悬液滴在滤纸上，每皿约20滴。恒温培养，取单菌落移接斜面。5.利用平皿的生化反应进行分离根据目的微生物特殊的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计分离培养基，通过观察目的微生物在选择性培养基上的生长状况或

13、生化反应进行分离。（1）透明圈法在平板中加入溶解性较差的底物，使培养基浑浊，能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反映该菌株利用底物的能力。如在分离脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、核酸酶等水解酶产生菌时采用较多。分离淀粉酶产生菌时，菌落形成后，可加碘液染色。分解核酸水解酶产生菌时，采用双层平板法：底层普通平板上涂布样品悬浮液，长出菌落后，再覆盖一层营养琼脂（含3%酵母RNA,0.7%琼脂，0.1MEDTA,Ph7.0）,42培养2-4h，四周产生透明圈的菌落，即是核酸分解酶产生菌。分离乳酸、柠檬酸等有机酸产生菌时，培养基中加入碳酸钙，使平板浑浊，样品悬浮液涂布平板，产酸菌能

14、把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明圈。（2）变色圈法在底物平板中加入指示剂或显色剂，快速鉴别目的微生物。筛选果胶酶产生菌时，用含0.2%果胶为唯一碳源的平板，涂布样品悬浮液，菌落长成后，加入0.2%刚果红染液染色4h，出现绛红色水解圈的菌落具有分解果胶的能力。分离谷氨酸产生菌时，培养基中加入溴百里酚蓝（变色范围6.2-7.6，6.2以下黄色，7.6以上蓝色），若菌落变成黄色，可能为谷氨酸产生菌。在分离解脂微生物、内肽酶产生菌、乳糖酶产生菌、乙醇产生菌等微生物时，都可采用特殊的鉴别培养基，根据透明圈或产生荧光等初步筛选目的微生物。也可根据目的微生物其他特殊生理特性，设计专一性的筛选方法。（3

15、）生长圈法通常用于分离筛选色氨酸、核苷酸和维生素产生菌。工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株。待检菌涂布于含高浓度工具菌并缺少所需营养物的平板上培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个浑浊的生长圈。（4）抑菌圈法常用于抗生素产生菌的分离筛选。工具菌采用抗生素的敏感菌，若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质（如抗生素等），便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈。灯片25（5）纸片培养显色法筛选谷氨酸菌种时，采用蛋白胨培养基，涂布样品悬浮液培养形成单菌落，用6-8mm打孔器把单菌落连同琼脂培养基逐个取出，放到灭过菌的滤纸上，放置一段时间，菌落产生的氨基酸会渗透并扩散到滤纸

16、上，喷上茚三酮，出现呈色圈者即为氨基酸产生菌。进一步将这些菌株摇瓶发酵，去发酵液进行电泳或纸层析，即可鉴别出产谷氨酸的发酵菌株。灯片27（三）微生物分离举例1红螺菌属Rhodospirillum）分离（此类菌生长于水和淤泥中，厌氧或微嗜氧，属光能有机营养型（光能异养），利用光能合成有机物）（1）富集培养培养基：NH4Cl1g，K2HPO40.5g，MgCl20.2g，NaCl2g，酵母膏0.1g，蒸馏水1000ml。灭菌后加入10%过滤除菌的NaHCO3,2ml乙醇或50ml4炳酸，用0.1N磷酸调pH至7.0。取暴露于阳光下富含有机质的淤泥适量于0ml带玻璃塞的磨口瓶中加满液体培养基，塞好塞

17、子，置30照明箱中培养，3天内可见深处培养基和淤泥中曝光的一侧呈现微红色的生长物。从微红色处取数毫升富集培养物，接种于第二瓶的富集培养基中，培2养天。（2）分离培养A、培养基：富集培养基中加入酵母膏0.2%，琼脂2%，碳酸氢钠改为2g。另取Na2s9H2O1g，加水10ml，灭菌，在调pH前加入到分离培养基中，灭菌后制成平板或柱状培养基。B、接种：取富集培养物在分离平板上划线或涂布，或用摇管法于柱状培养基中分离。前一种方法，可用焦性没食子酸和碳酸钠制造厌氧条件，或于缺氧条件下培养。挑选特征性细菌菌落，穿刺接种，塞紧管口，封蜡、培养后，待用。2.乳酸菌的分离筛选（1）保加利亚乳杆菌的分离筛选A、

18、富集培养：培养基为（）蛋白胨1,牛肉膏1,酵母膏0.5,葡萄糖2,土温800.1，磷酸氢二钾0.2，乙酸钠0.5，柠檬酸二胺0.2,硫酸镁0.005,pH6.2-6.6o进行富集培养。B、分离纯化：富集物稀释，涂布平板（加琼脂2%）,厌氧40培养2天，镜检。单菌落挑到5ml液体试管，40静止培养2天。C、菌种筛选：取发酵液放入150ml三角瓶，加水10ml,酚酞指示剂2滴，用0.1N氢氧化钠滴定到微红色，选出高产菌株。D、菌种保藏：穿刺接种保存。或离心收集菌体，悬浮于PH4.2乳酸缓冲液中，制成高浓度菌悬液，取10ml装入0.2mm厚的聚乙烯膜袋内，封口，5可保藏180天。菌种鉴定1.形态特征

19、2.生化指标3.基因测序细菌16s真菌18srDNA遗传基因型纯度的考察选育纯株的目的是提高菌株的纯度、稳定生产。因此，第三道选择性指标应当是菌种的纯度。纯种的标准有两个方面：（1）分离后表现的群体中菌落类型不宜太杂，愈少愈纯。菌落类型太多太杂，表明其遗传基因型分离大，不稳定。（2）主要菌型（主型）的百分比要高，应占群体总数的90以上。主型比例高表示了菌种的纯度高。菌种纯度不高，在生产中遇到外界条件的变动会产生生产水平的波动。传代稳定性实验很多微生物由于遗传基因型不稳定，在传代过程中有可能使低产型菌种的数量逐渐增多，以致在生产使用过程中产量愈来愈低。菌种在生产上使用一般要经过56次“传代”，这

20、就需要菌种的遗传性稳定，以保证稳定的生产水平。有的菌种甚至在制备两代沙土管或两代冷冻管的过程中就丢失了高产特性。因此在菌种筛选过程中必须进行通过斜面传35代的试验，选择连续传代后产量不下降的菌种用于生产。在传代试验时，要注意保证各代试验条件的一致性。第三节菌种保藏（1）目的：存活，不丢失，不污染；防止优良性状丧失；随时为生产、科研提供优良菌种。（2）原理：选用优良的纯种，（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞等），创造降低微生物代谢活动强度，生长繁殖受抑制，难以发生突变的环境条件。（其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养以及添加保护剂等）（3）菌种保藏的方法低温保藏法：方法：菌种管置4冰箱保藏，定时传

21、代。原理：低温下，微生物代谢强度明显下降。如：斜面传代法（3-6个月）、穿刺法（1年以上）、自然基质保藏法（小木块、小枝条、木屑、麸皮、麦粒等）、菌丝球保藏法（旺盛生长中的菌丝球4-5个放入无菌5mL生理盐水试管中，橡皮塞封口，4保藏，1-3年）。矿油保藏法：橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。如：液体石蜡法（矿油124灭菌30min,40干燥几天处理）、甘油管法（甘油终浓度40%,-20保藏）等。干燥保藏法将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保藏。如砂土管法,适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏,保藏时间几至几十年。如：沙土管保藏法、滤纸孢子保藏法等真空冷冻干燥法加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。液氮超低温保藏法将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（-196）。适用于各种微生物的较理想的保藏方法。干法保藏菌种的方法滴入小试管（在放入大试管干燥器中）藏在玻璃管内封入安培瓶菌液直接真空干燥法（L-干燥法）冷冻真空干燥法细粒状载体（土壤、沙粒、土壤+沙粒）球块状载体（硅胶、瓷球）合适的载体有机基质（曲料、麦粒）滤纸片薄片状载体明胶小片（滴在蜡纸板上干燥而成）血清蛋白小片（乙烯薄膜）几种常用菌种保藏方法的比较方法名称主要措施适宜菌种保藏期评价冰箱保藏法（斜