临床医学专业病原生物学实验课件

1、临床医学专业病原生物学实验实验一 培养基制备内容：培养基制备目的：1.掌握培养基制备的原理2.熟悉培养基制备的一般方法3.掌握高压蒸汽灭菌的原理与使用方法4.初步树立无菌操作的观念培养基的概念：培养基的种类：1.按物理性状分类2.按用途分类培养基的制备：原理：牛肉膏蛋白胨培养基（营养琼脂）是培养细菌的基础培养基，配方中的牛肉膏主要为微生物提供碳源，蛋白胨主要提供氮源，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时，还要加入琼脂作为凝固剂。由于培养基用于培养细菌，故必须进行pH的调整及其无菌和效能的检验。一、培养基制备材料：营养琼脂、蒸馏水、药勺、称量纸、天平、三角烧瓶、量筒、玻璃棒、pH试纸、10%

2、NaOH、比色管、牛皮纸、线绳、纱布、高压蒸汽灭菌器4）灭菌：用牛皮纸包装好上述的烧瓶，并做上 标记，进行高压灭菌。常用15磅的高压蒸汽 灭菌15-20分钟。5）分装：灭菌时间到后，待高压蒸汽灭菌锅内 压力下降至零时，取出烧瓶，待其冷却至 70时，在无菌操作下将营养琼脂倾注到灭 菌平皿内，厚度约为0.5-1.0cm。冷却至40 左右即成琼脂平板培养基。6）无菌检查：将上述的琼脂平板做上记号，然 后底朝上放在37的孵育箱内培养24h，以进 行无菌检验。二、高压蒸汽灭菌原理：水的沸点可随压力的增加而提高，当高压蒸汽灭菌锅中水煮沸时，因锅是密封的，蒸汽不外溢，而使锅内压力增加，水的沸点与温度也随之升

3、高。因此，高压蒸汽灭菌是利用高压蒸汽产生高温，以及热蒸汽的穿透力来达到灭菌的目的。一般在104.3kPa（15磅)的压力下，蒸汽温度达到121.3，维持15-20分钟，就能杀死包括芽胞在内的所有微生物。操作方法：1.加水于高压锅的外胆内至规定的位置。2.将待灭菌的物质放入高压锅的内胆，但不可放得过紧。 并把上述内胆放到高压锅内，盖上锅盖，把排球按插入 排气孔，旋紧压盖螺丝，使之严密。3.通电加热，当压力表指针指到5磅时，打开排气阀，使锅 内冷空气排尽。当压力表指针下降回零，将排气阀关好。4.继续加热，锅内压力逐渐升高，直至压力表上指针指到 15磅时，开始计时，维持该压力在15-20分钟内。5.

4、灭菌时间到后，停止加热，待压力下降到零磅时，打 开排气阀，使锅内外压力平衡，再开盖取物品。6.灭菌锅用完后，将锅内剩余水排掉，以免日久腐蚀。注意事项：1.外胆的水不宜过多，否则水沸腾时溢入内胆使物品浸 湿；但水也不可过少否则蒸气压力不够。2.在使用高压蒸汽灭菌时，应在加热后先将容器内冷空 气排尽，如果没有，则压力虽升高，但温度并没真正 升高，这样灭菌就不可靠。3.被灭菌的物品不要放置过多，塞得过紧，以免蒸汽不 能流畅，使水蒸气不能充分与物品接触，影响灭菌效 果。4.灭菌后要慢慢放气减压，以免容器中的液体及棉塞因 突然迅速减压冲出。若为纱布、衣服等应待放气完毕 隔半小时后取出，这样利用器内余热，

5、使之烘干。5.溶液灭菌时，瓶塞切勿用木塞或橡皮塞，因其内外压 力不一，可发生爆炸或液体溢出现象。 6.效能测定：为了确保灭菌效果，应定期检查灭菌效能。 常用的方法是用硫磺粉末（熔点为115）或安息香酸 （熔点为120 ）将其置于试管内，如上述物质熔化， 即说明高压蒸汽内温度已达到要求，灭菌效果是可靠 的。一、细菌的分离接种培养【原理】：多种细菌混杂时，欲分离某一种细菌，可采用平板画线分离方法，将混杂的细菌分离。经过培养，单个细菌能形成菌落，挑取单个菌落可获得纯菌种。【材料】： 金黄的葡萄球菌和大肠杆菌的混合菌液、 普通琼脂平板、接种环、酒精灯、【方法】：1.左手持菌管下端，右手持接种环烧灼灭菌

6、。2.在酒精灯火焰旁，以右手的小鱼际肌、小指夹 住试管帽，并将试管口通过火焰。3.用已烧灼后冷却过的接种环挑取混合菌液，取 完后，管口通过火焰，盖上试管帽，放回试管 架。左手持琼脂平板，在火焰旁打开平皿盖约 45，将接种环上的细菌在平板上的一侧边 缘涂开。然后以接种环与平板成30-40，轻 触平板，通过涂菌处以腕力轻快的滑移接种环， 作13区域画线，画线要密但不能重叠。二、细菌的分布【原理目的】：细菌分布很广，在自然界的空气、土壤、水等均有分布，而且在人体的体表及与外界相通的腔道内都有分布。通过该实验的操作，要求同学牢固树立无菌操作的观念。【材料】：普通琼脂平板、75%酒精、碘酒、棉签、玻璃笔

7、、生理盐水、空气中的微生物分布【方法】：1.一个实验班提供两块琼脂平板，分别对 它们做上记号，然后一块放在实验室前 面，一块放在实验室后面，均打开平皿 盖，暴露空气中30分钟。2.时间到后，盖上平皿盖，倒置于37的 温箱内培养24h。人体微生物的分布【方法】：1.每人一块平板，用玻璃笔在平皿底部画一“十” 字号，同时分别在四个区作“前”、“后”、“鼻”、 “任”标记。2.在酒精灯火焰旁，左手打开平皿盖45，取右 手任一手指，不要做任何处理，在平皿内对应 的“前”的位置上，作涂布。然后取出手指，盖 上平皿盖，用棉签分别蘸取碘酒、75%酒精对 该手指的末端进行消毒，待酒精挥发干后，打 开平皿盖45

8、，在平皿内对应“后”的位置上， 作涂布。然后取出手指，盖上平皿盖。3.在酒精灯火焰旁，取一棉签，蘸取生理盐水， 在鼻腔内取分泌物，打开平皿盖45，在平皿 内对应“鼻”的位置上，作涂布。然后取出棉 签，盖上平皿盖。棉签丢在规定的位置。 4.在酒精灯火焰旁，取一棉签，蘸取生理盐水， 在任何部位擦拭后，打开平皿盖45，在平皿 内对应“任”的位置上，作涂布。然后取出棉 签，盖上平皿盖。棉签丢在规定的位置。5.作完，在平皿底部做记号，倒置于37温箱培 养24h。实验三 细菌革兰染色【内容】：1.油镜使用2.细菌革兰染色【目的】：1.掌握应用油镜进行细菌形态的观察2.掌握细菌革兰染色的原理、步骤、意义、目

9、镜物镜聚光镜光学系统推片器物镜转换器镜筒镜臂玻片固定器调光手轮粗调节螺旋细调节螺旋载物台机械系统底座4.油镜观察完毕后取下标本片，按老师指 定位置放好.并下降载物台约10mm，把物 镜转到一边，立即用擦镜纸拭去镜头上 的石蜡油.二、革兰氏染色革兰染色的原理：1.细胞壁结构学说： 革兰阳性菌细胞壁结构致密，肽聚糖层厚，脂质含量 少，乙醇不易渗入；革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽 聚糖层薄，含大量脂质，乙醇容易渗入。2.等电点学说： 革兰阳性菌等电点（pH23）比革兰阴性菌等电点 （pH45）低，在相同的pH条件下，革兰阳性菌所带的 负电荷比革兰阴性菌多，故与带正电荷的结晶紫结合牢 固，不易被95%乙

10、醇脱色。革兰氏染色的方法： 1.材料： 菌种：大肠杆菌与葡萄球菌分区划线平板、 染液：结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%酒精、 石碳酸复红染液、玻片、生理盐水、 酒精灯、接种环、石蜡油、吸水纸、 擦镜纸、2.步骤：（1）涂片： 取一干净玻片，在玻片中央滴一滴无菌生理盐水，然后点燃 酒精灯，在相对无菌环境下，把接种环在火焰上灭菌后，于 上次分离划线的平板里取少许混合细菌，与生理盐水均匀混 合，涂成约1cm1cm大小的薄膜，接种环灭菌放回试管架。（2）固定： 把上述玻片的背面放在酒精灯外焰上方高处烘干；然后手持 玻片一端，将玻片背面往返通过酒精灯内焰三次；固定完毕 后，待冷却再染色。（3）染色： 初染

11、：在固定好的细菌涂片上滴加结晶紫染液23滴，以 全面覆盖菌膜为度，染色1分钟后，将玻片用细水冲洗（不 能对着标本冲，应玻片倾斜水从上而下冲）至水流无色为 止，甩干。 媒染：滴加卢戈氏碘液数滴，染色1分钟后用细水冲洗，甩 干。 脱色：滴加95%酒精一滴，轻轻摇动玻片，使均匀脱色20 秒，用细水冲洗，直至由原来淡紫色到无色，甩干。 复染：滴加稀释石碳酸复红一滴，复染20秒，用细水冲洗 到水流无色，甩干，再用吸水纸吸干。油镜观察： 待玻片干燥后，在涂菌处滴一滴石蜡油，然后放到显微镜上 应用油镜观察。结果： 染成紫色的是革兰阳性菌（葡萄球菌） 染成红色的是革兰阴性菌（大肠杆菌）革兰染色的意义： 1.将

12、细菌分成两大类。 2.分析细菌的致病性。 3.临床药物的选择。注意事项：细菌涂片、干燥、固定初染： 结晶紫 1分钟甩干媒染： 卢戈氏碘液 1分钟甩干脱色： 95%酒精 20秒甩干复染： 石炭酸复红 20秒吸干 油镜观察水洗水洗水洗水洗一、消毒灭菌掌握消毒、灭菌、无菌的概念。目的：掌握常用的物理消毒灭菌方法。方法：1.煮沸法：（目的：煮沸原理、细菌在液体培养基中的生长情 况）原理：水温100维持10分钟可杀死细菌的繁殖体，细菌的芽 胞需煮沸1-2小时才杀灭。常用于消毒食具、刀剪、 注射器等。步骤：（四个人一个小组）1）材料：大肠杆菌菌液、枯草杆菌菌液（含芽胞）、肉汤培 养基、接种环、酒精灯、水浴

13、箱、2）取四根肉汤培养管，分别用A、B、C、D编号。3）右手持接种环灭菌冷却后挑取单一菌落，左手持肉汤培 养基与桌面呈45，用左手的小指与小鱼际肌拔取试管 塞，将管口通过火焰旋转烧灼；然后将沾有细菌的接种 环移入肉汤培养基中，于液面相对的那一侧管壁并接近 液面处研磨，沾取少许液体肉汤与之调和，使菌液混于 培养基中。（用上述方法将细菌分别接种到A、B、C、D 试管中）4）将上述的B、C两管用试管夹夹着放置100沸水中煮沸10 分钟。5）10分钟后，将A、B、C、D 四管置37温箱培养24小时， 观察结果 。液体接种法ABCD枯草杆菌大肠杆菌100度水浴10分钟100 5min100 5min37

14、 24h菌膜澄清浑浊试验管枯草杆菌大肠杆菌实 验 四【内容】：1.物理、化学因素对细菌的影响2.肠道细菌的生化试验【目的】：1.掌握紫外线消毒灭菌的原理及适用范围。2.掌握纸片法药敏试验的原理及结果判断。3.掌握鉴别肠道细菌的常用试验及其原理、结果判断。二.紫外线法：原理：波长200-300nm的紫外线与DNA吸收波峰一样，尤其 265-266nm的杀菌作用最强，易被细菌DNA吸收，导 致细菌的死亡。但紫外线的穿透力弱，玻璃、纸张、 尘埃等均能阻挡，故只能适用于直接照射物体表面 与空气的消毒，而且对人的皮肤、眼睛有损伤作用。 同时紫外线消毒有光复活效应。方法：1.材料：普通琼脂平板、大肠杆菌菌

15、种、接种环、镊子、 黑纸片、人工紫外灯、酒精灯等。2.点燃酒精灯，在无菌操作下，用烧灼灭菌过的接种环挑取大 肠杆菌菌落，在普通琼脂平板上交叉密集划线。3.在无菌操作下，用无菌镊子夹取黑纸片一张， 半启皿盖，将黑纸片放在中央，黑色朝上， 并用无菌镊子轻压黑纸片四角，使它贴紧平 板，然后盖上皿盖。4.将上述平板放在无菌操作台上，全开皿盖，在 人工紫外灯下照射30分钟。5.30分钟后，无菌操作下，在无菌操作台内用无 菌镊子夹出黑纸片，盖上皿盖，皿底朝上置 37温箱培养24小时，观察结果。三、抗生素敏感试验1.常用的方法有琼脂扩散法和连续稀释法。临床工作中 常用标准纸片琼脂扩散法，即K-B法。2.原理

16、：含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的 琼脂平板上，纸片中的药物便不断向纸片周围区域扩 散，形成递减的浓度梯度，在纸片周围抑菌浓度范围 内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈，抑菌圈 的直径大小反映测试菌对该药物的敏感性程度，并与 该药物对测试菌的MIC呈负相关，即抑菌圈直径越大， MIC值越小。该方法是定性试验，可用于选择敏感药物 及评估药物的抗菌谱。3.结果判断：常用三级划分制，即敏感、中度敏感、耐药步骤：（两个人一组）1.材料：葡萄球菌和大肠杆菌菌液、固体琼脂平板、无菌棉签、 酒精灯、各种抗生素滤纸片、镊子等。2.方法：两个同学一组，其中一个同学用连续交叉划线的方法将葡萄 球菌用无菌

17、操作技术接种到琼脂平板上，另一同学用同样方法接种大肠杆菌。用无菌镊子取4种不同的抗生素滤纸片，放于上述接种完细 菌的培养基表面上。（注意两两抗生素滤纸片之间距离不小 于2cm，纸片与平皿边缘距离不小于1cm）并在平皿底部作上 标记。平皿底朝上放在37温箱中培养24小时后，用尺子测量各抑 菌圈的直径，并分析结果。 抗 生 素菌种金葡菌大肠杆菌结果分析：一、肠道细菌的生化试验目的： 了解肠道细菌各种生化试验的原理、结果判断及用途等。内容： 1.糖发酵试验： 原理：不同的细菌含有不同的糖分解酶，因此分解糖的 能力不同，有的产酸，有的产气。检查细菌糖发酵后产 酸或产酸产气的能力，可协助鉴别细菌，尤其在

18、判断肠 道细菌致病性中常用。（酸用酚红指示剂检查） 结果：2.吲哚试验：原理：有些细菌（如大肠杆菌）具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚（即靛基质）。吲哚无色，不易观察，加入吲哚试剂后，试剂中的对二甲基氨基苯甲醛与吲哚结合，生成红色的玫瑰吲哚，易观察。主要用于肠道细菌的鉴别。 结果：色氨酸吲哚玫瑰吲哚 吲哚试剂3.硫化氢试验： 原理：某些细菌（如变形杆菌）具有半胱氨酸 酶，能分解培养基中的含硫氨基酸生成硫化氢， 硫化氢是一种无色气体，与培养基中的醋酸铅 或硫酸亚铁作用生成黑色的硫化铅或硫化亚铁 沉淀。在肠道细菌的鉴别中具有重要作用。H2S试验微量管（半固体培养基）操作：材料：1.大肠杆菌、变形杆菌、乙型副伤寒杆菌的固体平板。2.乳糖、葡萄糖、硫化氢试验的微量反应管。3.接种针、酒精灯、磨砂、孵育箱、方法：1.糖发酵微量管（两个同学一