细胞工程学 第2章课件

1、细胞培养前的准备工作 第 二 章 细胞培养技术是生命科学中常用的研究手段，动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使细胞或组织在体外生存、生长并维持结构和功能的一门技术。 细胞培养( Cell culture )：指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟机体的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。 活细胞是构成活的有机体的基本单位。 生、老、病、死、优生、抗衰老、防治各种疾病的途径、人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，等等均与活细胞的研究密切相关。第一节 细胞培养研究的发展简史18

2、39年：T.A.H.Schwann（德） 动物学家施旺受到施莱登的启发，结合自身的动物细胞研究成果，把细胞说扩大到动物界，提出一切动物组织均由细胞组成，从而建立了生物学中统一的细胞学说。 1859年：Vupian(法) 蛙尾部组织切下放入普通水中进行“培养”，观察到生长和分化现象。1885年：Roux(德) 把鸡胚的神经板在温热的生理盐水中维持其存活数天，这是有记录的第一个体外移植成功的例子，也是首次体外培养的尝试 。1906年：SP Beele J Ewing 盖片悬滴法用动物血清使狗的淋巴肉瘤细胞在体外存活了72小时。 体外培养技术的开端。问题：血浆与血清的区别？ 血浆是离开血管的全血经抗

3、凝处理后，通过离心沉淀，所获得的不含细胞成分的液体，其中含有纤维蛋白原（纤维蛋白原能转换成纤维蛋白，具有凝血作用），若向血浆中加入Ca2+ ，血浆会发生再凝固，因此血浆中不含游离的Ca2+。血浆和血清的区别 血清是离体的血液凝固之后，经血凝块聚缩释出的液体，其中已无纤维蛋白原，但含有游离的 Ca2+，若向其中再加入 Ca2+，血清也不会再凝固。 血清中少了很多的凝血因子，但多了很多的凝血产物。另外，血清中含有特异性免疫体(如抗毒素或凝集素)的免疫血清(抗菌素血清)。 1907年的实验标志着： 体外培养技术创立； 盖玻片悬滴法的建立； 神经组织体外培养的开始； 神经突起是由神经细胞长出的重大理论

4、诞生。法国科学家A.Carrel的实验贡献: 第一次将无菌操作概念引入体外培养实验中。 创立培养组织包埋技术、营养供应以及传代培养等许多条件和方法并引入盖玻片悬滴培养系统。 1911年：M R Lewis 和W H Lewis兄弟对体外细胞生存所必需的条件进行了研究初步探索，研究了NaCl、CaCl、KCl、NaHCO3等生理盐溶液成分与培养物生长的关系。1913年：Steinhand 体外培养痘苗病毒，为病毒学应用奠定基础。 1915年：Goldschmidt 无脊椎动物组织的体外培养，成功的培养了鳞翅目昆虫组织。1925年：Maximow 双盖片悬滴培养法。1926年： Carrely 卡

5、氏瓶培养法，开创玻璃瓶培养方法。1926年：Strangeways 试管培养法。1933年：Gel 旋转管培养法，并以此建立了许多细胞系，如：Hela细胞系。1949年：Polge等 发现甘油保护储存细胞功能，解决冷冻细胞受损的问题。 1950年：Morgan等人提出的199人工培养基 配方。1951年：Shannon和Earle建立T瓶培养法。1951年：Poment改良和设计了结构简单 且易于消毒的灌流小室，使得 体外培养的细胞能够在不断更 新的培养液中生长。1954年：Earle建立了悬浮培养法。1957年：Dullbecco等人开始采用胰蛋 白酶消化处理来分离细胞的方法以及应用液体培养

6、基的方法，使得体外培养单层细胞成为可能。1959年：Lovelock发现了一种新的化学冷冻保护剂二甲亚砜，冻存细胞效果更好。第二节 细胞培养室和仪器设备的准备 细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。 准备室：培养器皿的清洗、烘干、包装、培养物品的消毒、培养用液的配制以及供应物品的储藏。缓冲室：换取消毒服、帽、罩、鞋等。培养室：专用进行细胞培养和各种无菌操作的实验室。 培 养 室门：用拉门减少扬尘，迷宫式分布。窗：最好无窗，避免直射，减少温差变化。墙：光滑、不反光、不刺激。地：用瓷砖或水磨石铺，既光洁又防滑。灯：荧光灯、紫外灯、煤气灯或酒精灯

7、。台：超净工作台、操作台。二、细胞培养的仪器设备1、 超净工作台2、培养设备（1）恒温培养箱： 干热式；隔水式。（2）CO2培养箱： 5%CO2，维持培养液pH稳定 减缓培养液的酸化。3、消毒设备 （1）高压蒸汽消毒锅 （2）电热干燥箱 （3）过滤除菌装置 4、冰 箱（1）家用冰箱 （2）低温冰箱 （3）冷藏柜 （4）冷冻柜 5、水质纯化装置（1）重蒸水装置（2）去离子水制备（3）逆向渗透净水装置 水质处理与制备重蒸水蒸馏器去离子水生产机6、显 微 镜（1）倒置相差显微镜 （2）荧光显微镜 （3）紫外光显微镜 （4）普通光学显微镜相差显微镜荧光显微镜 用荧光染料对细胞中成分进行特异染色，由染料

8、发出的荧光称为染色荧光。 经化学反应使组织中非荧光物质转变为荧光物质所发的荧光称为诱发荧光。 7、离 心 机（1）台式离心机 （2）冷冻高速离心机 台式离心机高速冷冻离心机8、细胞冷冻贮存装置 1液氮罐 2超低温冰箱 液氮罐超低温冰箱9.其它仪器设备 （1）清洗装置： 浸泡器皿、冲洗水槽、超声波玻璃器皿洗涤机等。 （2）酸 度 机： 甘汞电极酸度计 电子精密酸度计 甘汞电极酸度仪（3）天 平 电子天平 电光天平 普通天平（4）消化设备恒温水浴锅 恒温磁力搅拌器旋涡震荡器三、实验室器具器皿1、金属器具解剖剪刀止血钳镊子刀片解剖刀2、玻璃器皿和塑料器皿 3、辅助工具各式移液器第三节培养器具器皿的清

9、洗、包装、消毒一、清洗与包扎 清洗和消毒好的玻璃器皿，一方面防止细菌污染，另一方面有利于细胞的粘附和生长。玻璃表面性质与细胞的粘附和生长能力有关。 1清洗玻璃器皿的流程浸泡 洗涤 冲洗 烘干 酸浸 冲洗 蒸馏水冲洗 沥水 烘干 包扎洗 涤 剂1洗洁净类2强氧化剂类强酸洗液的配制：弱液： 重铬酸钾 50g 蒸馏水 1000ml 浓硫酸 90ml 强液： 重铬酸钾 120g 蒸馏水 1000ml 浓硫酸 160ml(先加热溶解重铬酸钾，冷后缓缓加入浓硫酸)2、清洗橡胶制品的流程 新制品：浸泡 碱煮（0.5mol/L NaOH 30min） 冲洗 酸煮（0.5mol/L HCl 30min） 冲洗

10、蒸馏水冲洗 烘干 包扎旧制品：水煮 冲洗 蒸馏水冲洗 烘干 包扎 3、清洗金属制品的流程 75%酒精擦洗超净台处吹干包扎 二、消毒灭菌 消毒方法分为三类：物理消毒法化学消毒法抗生素抑菌法（一）物理消毒法 1、高压蒸气消毒玻璃器皿 15磅 121 30分橡胶制品 15磅 121 15分 塑料制品 5磅 108 15分2、干热消毒 消毒耐高温的材料器皿， 如玻璃、金属等。 一般 160 60分钟。 注意：冷却后才能打开烘箱门 ，防止玻璃爆裂或起火燃烧。3、滤过消毒（1）负压滤过 （2）正压滤过 4、紫外线消毒 环境消毒5、辐射消毒 由60Co产生的射线，穿透力强，灭菌物品不升温。6、煮沸消毒 适宜

11、于临时需要消毒的耐热物品，如金属器具和注射器等在水中煮沸2030分钟即可用。 （二）化学消毒法 化学消毒剂，包括酒精、新洁尔灭、来苏儿、过氧乙酸、环氧乙烷、碘酒、戊二醛等。 （三）抗生素消毒法 抗生素消毒作用主要是抑制液体内的细菌繁殖，因此适用于细胞培养用液的消毒。实验室常用的是青、链霉素混合液也称“双抗”液，还有卡那霉素液等，其抑菌效果均很好。 培养用品清洗和消毒程序 细胞培养实验必须注意什么？第四节 培养用液的制备 一、培养用液的组成 1水 作用：（1）细胞赖以生存的主要条件；（2）维持细胞形态；（3）进行生物化学反应；（4）温度传导；（5）调节渗透压和酸碱度的平衡。 2平衡盐溶液 用途：

12、洗涤组织、细胞以及配制各种培养用液的基础溶液。作用：（1）维持渗透压；（2）调控酸碱平衡；（3）供给细胞生存所需能量和无机离子成分。 3、天然培养基 血清、组织提取液（如鸡血浆、鸡胎汁等），血清是一种广泛应用的天然培养基，市场有售，血浆应用较少，用时多自己制备。 （1）鸡血浆的制备？（2）鸡胚浸出液的制备 鸡胚浸出液的制备过程（3）血 清 1） 种类： 人血清 胎牛血清 动物血清 牛血清 小牛血清 马血清 2）成分 蛋白质（血清的主要成分） 主要为白蛋白和球蛋白；如纤维粘连素能促进细胞附着；2巨球蛋白有抑制胰蛋白酶的作用；转铁蛋白能结合铁离子，减少其毒性和被细胞所利用。 多肽 凝成血块后析出的

13、血清有增殖作用，要比去掉血细胞后分离出的血浆作用强。原因是在凝血过程中从血小板释放出一种多肽血小板促生长因子（PDGF）的结果。 多肽血小板促生长因子（PDGF）是促细胞分裂多肽家族成员之一，是血清中主要促细胞增殖因子。PDGF有促成纤维细胞和胶质细胞增殖的作用，但对上皮细胞增殖的作用可能为促细胞分化。 现已从组织中分离出其它生长因子如成纤维细胞生长因子（FGF）、表皮细胞生长因子（EGF）、增殖刺激素（MSA）等，这些因子在血清中则含量不高。 激 素 激素多方面对细胞作用。胰岛素（INS）有促细胞摄取葡萄糖和氨基酸的作用，这些作用可能与其促细胞分裂相关。其 它 成 分血清中还含有：氨基酸葡萄

14、糖酮酸一些与蛋白相结合状态的微量元素一些抑制细胞增殖的成分 （4）水解乳蛋白 常用的天然培养基，水解乳蛋白是乳白蛋白经蛋白酶和肽酶水解的产物。含有丰富的氨基酸；用与原代细胞培养效果很好。 （5）胶 原 胶原是细胞生长良好的基质，是从动物组织中用人工的方法提取出的，利于组织和细胞的固定，属于天然培养基。 胶原主要用于细胞的附着，能改善细胞表面的性质，促细胞生长。胶原可来自大鼠尾腱、豚鼠真皮、牛真皮、牛眼水晶体等，其中以鼠尾胶原最为常用和制备简便。 例：鼠尾胶原制法如下：1）取组织：大鼠一只，从尾根切断鼠尾，置75%酒精中浸泡30分钟；无菌条件下，抽出尾腱置平皿中并切成1.5cm小段；2）溶解：取

15、1.5g尾腱浸入150ml醋酸溶液（0.010.25M），置4冰箱中，并不时摇动，48小时后，移入灭菌离心管；3）分离：4000转/分，离心30分钟，吸取上清液，10磅10分钟高压灭菌后分装入小瓶，-20冰箱保存。4）使用方法：用吸管吸取少许胶原涂于灭菌培养瓶内壁上，不宜太厚以倾斜瓶时不流动为准；5）向培养瓶内通以氨气后封上瓶盖作用30分钟（若不用氨气处理，则置37温箱过夜，或置室温48小时，再用无菌水冲洗凉干）。待胶原凝固，然后用无菌生理盐水冲洗、凉干，即可使用。4、合成培养基 （1）定义：按人和动物体内细胞成分模拟合成的、配方恒定的一种较理想的培养基。 合成培养基的出现，促进了组织培养的发

16、展，减少了生物个体差异的影响。目的在于创制出与体内相似的生存环境。合成培养基有固定的组成成分，有利于控制实验条件的标准化。（2）合成培养基的成分氨基酸：几乎所有细胞对谷氨酰胺有较高要求，是细胞赖以合成核酸和蛋白质的物质。缺少谷氨酰胺细胞会因生长不良而死亡。维生素：维持细胞生长的生物活性物质，对细胞代谢有重大影响。可分为水溶性和脂溶性两大类。 无机离子：除Na、K、Ca、P等大量元素外，还需一些微量元素，如Cu2、Zn2、Fe2等。碳水化合物：细胞生命的能量来源，也有一些是蛋白质和核酸的成分，主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠、醋酸钠等。其它成分抗氧化剂如抗坏血酸、谷光甘肽等三磷酸酰苷（AT

17、P）辅酶A核酸降解物如嘌呤与嘧啶类 （3）合成培养基的分类 生长培养液 用以维持细胞生长增殖。含血清比例大，是培养工作中最主要的培养用液，其组成为： 基本培养基 80%90% 血清(多用小牛血清) 10%20% 抗生素(多用青霉素100u/ml和链霉素100u/ml)维 持 液 维持细胞缓慢生长或不死，血清含量很少，一般细胞因缺少生长因子时不能增殖，生长缓慢，但发生转化或癌细胞因自身有产生促生长增殖因子的能力，在血清缺少情况下仍能生长；可用于选择发生恶性转化的细胞。其组成为： 基本培养基 95% 血清 2%5% 注意：如果培养正常细胞完全不加血清，可维持细胞不死，但时间过长细胞难免退化。 合成

18、培养基的种类Eagle，s、Dulbecco，、Ham，s、CMRL、RPMI、Waymouth，s、MoCoy，s、Iscove，sMEM 、F12、 1066 、 1640 、 MB751/1 、 5A 、 DMEML15、 NCTC109、 199、 Fischer 5、无血清培养基 血清在体外培养细胞中提供细胞增殖所必需的生长因子，大多数动物细胞体外培养都不同程度依赖血清才能生长增殖。但血清的成分也很复杂，能直接影响实验结果。 血清中还有一些有害物和抑制物，对细胞有去分化的作用，影响细胞的功能表达。因此，许多研究工作需要在培养基中不含血清和其他天然培养基。 无血清培养基研制难度大，要设

19、计出一种万能的无血清培养基非常困难。 继续设计新的、能适应多种类型体外生长增殖的无血清培养基。在研究生长因子等工作的基础上，向人工合成培养基内补加一定的激素、生长因子等已知物质来支持细胞的生长和增殖。 无血清培养基设计趋势6其它常用液 （1）消化液 分离组织和分散细胞用的。如：胰蛋白酶、胶原酶、二乙胺四乙酸二钠（EDTA）。 胰蛋白酶 采自牛或猪的胰脏,易潮解，置于阴暗干燥处保存。 主要作用：水解细胞间蛋白质，使细胞相互离散。 活力表示：以解离酪蛋白的能力表示。胰蛋白酶对细胞的分离作用与细胞的类型和特性有密切的关系。浓度大、温度高、作用时间越长，对细胞的分离能力最大，但超过一定限度也会损伤细胞。 胰蛋白酶溶液在pH7.2，温度为37时，作用能力最强。此外，钙、镁离子和血清蛋白的存在会降低其活力。 *胰蛋白酶溶液用无钙、镁离子的溶液进行配制。 *消化时加入一些血清或含血清培养液，