液相常见问题汇总

1、常见色谱分析问题解疑一、产生前沿和拖尾的原因一般有哪些?(1）拖尾： 2 色谱柱塌陷,更换色谱柱 3 流动相pH不合适，调节 pH 值 4 管路没有接好，存在较大的死体积，可以重新接一下（2）前沿:1 溶剂选择不合适,选择合适的溶剂 2 样品过载,降低进样量 3 柱温太低，升高柱温 4 色谱柱损坏，更换色谱柱 5 干扰峰，优化色谱条件分离2.流动相不恰当3.定容样品的溶剂不合适产生峰前沿的原因：柱过载，柱头塌陷，溶剂选择不对产生峰拖尾的原因：存在杂质未分开，柱污染，柱子选择不对.拖尾峰与柱子有关,可能是过载,稀释样品再做,或换新柱做吧一般产生托尾峰往往是有机性相近杂质没有分开，可以优化分析方塌

2、陷等原因;再有也会根样品本身性质有关，基团需要流动相中添加染了吧，溶剂也可能有，或柱效下降。酸碱在流动相中对于前沿和拖尾影响较大。柱前沿是可能因为柱超载，拖尾是可能因为样品被污染 ,选择合适的流动相，调节好PH能够改善这以情况.二、怎样避免拖尾和前沿，有何措施？选择合适的色谱条件和色谱柱，就可以避免峰拖尾和前沿解所要分离的物质的化学性质和溶解度、极性等相关问题 ,摸条件时找到较好的流动相，是避免拖尾峰出现的最好方法。范围,超过这一范围不对称峰则会出现。要看是由于什么原因造成的:处理非常重要，部分样品在分析过程中分解,那肯定是拖尾的。如三乙胺、醋酸等。尾有什么好的建议吗?对于生物碱类,应该选用封

3、端了的色谱柱 ,减少硅羟基的作用,还有就是调节流动相的PH值来避免拖尾对于生物碱类成分的分离关键在于加入的酸的量，因为你得让成啊，所以注意你的酸的加入量吧！还有就是选择合适的色谱柱，最重要喽！生物碱类液相色谱一般都会在流动相里加入少量碱（二乙胺或氨水 PH偏碱性。不过用普通的C18柱来分析可能进不了几针柱效就不行了,考虑使用宽PH范围的 C18柱.关 于 生 物 碱 薄 层 问 题 ， 可 以 对 于 薄 层 板 的 话 可 以 用10%NaOH+CMC-Na 溶液进行铺板,还可以适当调节展开剂 PH 值来防治生物碱拖尾.应该加三乙胺吧,及三氟乙酸等调节PH管怎么说首先考虑的是色谱柱的选择。四

4、、用 HPLC 进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在?如何解决？关于漂移问题： 温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定 流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等 柱子未平衡好,需对柱子进行更长时间的平衡关于快速变化问题 流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定 泵中有气泡,可通过排气等操作将气泡赶出。 进行适当混合五、液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？ 换柱子。 选择性好的柱子 可能柱超载，减少进样量。六、HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法 样品量不足，解决办法为增加样品量 子 样品与检测器不匹配.根据样品化学性质调整波长或

5、改换检测器 检测器衰减太多。调整衰减即可。 检测器时间常数太大.解决办法为降低时间参数 检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗。 检测池中有气泡。解决办法为排气。 记录仪测压范围不当。调整电压范围即可。 流动相流量不合适。调整流速即可. 检测器与记录仪超出校正曲线.解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线.七、做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在？如何解决? 理; 比例阀失效,更换比例阀即可； 泵密封垫损坏,更换密封垫即可； 溶剂中的气泡,解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法； 系统检漏，找出漏点，密封即可； 梯度洗脱，这时压力波动是正常的。八、最近更换了另一种牌号的ODS 柱，虽然分离

6、情况仍可以，但保留时间不能重现,为什么？料的制造技术有了极大的提高，但不同的厂商的ODS 填料表面硅醇基的浓度不同。正是这些硅醇基可能与样品发生相互作用。因此，同一被分析物中的各组分在不同牌号的ODS 柱上的相对保留时间就可有较好的重现性.如分离情况可以，系统稳定，达到系统适用性要求，就不必保留时间的重现。九、购买的HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么？柱压过高是HPLC常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。 拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查; 洗，若压力下降，再检查； 将柱子的进出口反过来接在仪器上，用 10 倍柱体积的流动相如果柱压

7、仍不下降，再检查；只用于使用过的柱子。 杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系.一般情况下，在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可提供的Rheodyne 7315型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。十、色谱双峰产生的可能及判断和处理HPLC分析中,在色谱柱正常，样品灵敏度足够，分析方法合适，但是,在对样品了解程度不够，方法不妥，样品处理方法及进样方式不合理下，会出现各种意想不到的问题,而对色谱峰难以作出合理的解释，尤其对于新手更是如此.下面根据本人几年工作的体会，提出一些看法，向同仁指教。二种物质。我将这种情况分为四种原因。1、色谱柱色谱峰的形状多为一大峰带一小峰

8、,不一定拖尾，这一般应是柱头受堵，将色谱柱反过来接，用流动相冲洗或酸洗或其它溶剂，将堵在柱头的残留物冲掉，再反过来，一般情况下就行了。当然不反冲，正冲有时也会正常的。如果峰拖尾，双峰强弱相差不大，柱头固定相变脏或流失可能性更大,这是可以将进样那头拧开，将微孔滤片超声,柱头废。2、溶剂极性及进样量许多HPLC分析者对此可能不以为然，一般的HPLC的书籍和文献都不会提到这方面的内容 ,而这确是双峰产生的一个很重要的原因。目前 HPLC 分析多为反相色谱,流动相多为甲醇、乙腈、水，加各种添加剂以改善分离性能。样品一般用与流动相相溶的溶剂溶解。最佳的溶解方法是用流动相溶解,但是很多情况是不一致的。当用

9、溶剂极性强度大的试剂,如纯甲醇、纯乙腈，纯乙醇，而分析体系中以水为主，样品进样量大,如定量管为 20ul，此条件下完全可以肯定，单一的纯物质出双峰,第二峰比第一峰小(每次都不太一样)，且拖尾,保留时间会提前（相对进样量少而言）,将进样量减少一半以上,峰型将变为正常。这是样品的溶剂与流动相极性相差太大 ,而流动相来不及将其稀释达到平衡造成的。上面提到进样量造成双峰的一个原因，另一个原因是，进样量不一定大，但绝对量很大，色谱图上的双峰紧的。3、样品的特性有些样品由于其化学结构的特点，存在互变异构现象，而这种互变异构体无法分开，而是以一个动态平衡存在.在色谱分析时，在一个特定的条件下,一种物质将出现

10、双峰，双峰靠的很近,基本齐高，不 品紫外的色谱图上看不到双峰，但在 下，用质谱检测器,其4、参数 GC和 HPLC的参数是不完全一致的，例如 CR3A 数据记录仪上的一般记录时间间隔 GC 为为5ms，如果记录间隔时间缩短，一个峰将变为二个峰或更多。系统堵塞问:我的系统压力比它应该的压力高很多，是什么原因？答：首先，让我们检查一下你的前提,你怎么知道压力应该是多少？问：之前同样的柱子,同样的流动相，同样温度压力只有 2000PSI。现在是两部了。我把泵压的上限设为4000PSI,泵停了.答：很好你有以前的参考数据，我们可以从这里开始排查故障 .压力变大，原因很多。首先，流动相的粘度可能不对 .

11、其次，系统某个地方可能堵了。后者比较常见，但是在我们拆系统前 ,先检查下其他的可能。你确定你的流动相是对的？如果用的是自动混合 ,你溶液有没有放如果使用了柱温箱加热，确认一下它有没有工作。温度每变 10粘度变化25%.所以如果你本来要开压力就会翻倍了。问：OK，这个很容易检查,其它还有哪些要检查的？出现的。如果是突然出现的,可能是有些错误发生了。让我们来检查颗粒大小的平方成比例变化.如果你用 5um 的柱子代替 10um 的柱子，就可以解释压力的增加了。不是这种情况，那么就有地方堵住了。首先卸掉柱子接二通 ,保护柱和柱前过滤器不要下下来.我们要检查的一个可能是流动相不相容,如果接分析柱在后面的

12、操作中可能对其有损。不连柱子，检查压力，如果还有1500多psi，那么是其他地方堵了,柱子是好的。我们可以在掉的是什么东西,那么就很容易知道怎么洗.假设是滤头堵了，可能是间就可以了.如果是分析柱或保护柱突然堵塞，就要检查柱子的保存溶剂 .保存溶保存，而柱塞松动,导致流动相部分蒸发，有盐析出。这时要用能溶解该盐的流动相低流速冲洗柱子来恢复活性.问:我的情况是在运行序列中间突然出现的，这是怎么回事呢？答：这种情况可能是系统的某部分被积累的小颗粒堵塞了 .小颗粒可附在保护柱或分析柱(没用保护柱）上。这通常是样品中大分子量的组分,而你没有去除或者只是部分去除掉了,如血清样品中的蛋白质，制剂中的辅料或食

13、品中的高分量组分.如果你用了柱前过滤器和保护柱,让我们依次下下来，测量系统压力。这样，我们应该可以很快找到堵塞的部位.如果是保护柱和柱前过滤器堵了,最好更换掉。它们就是用来保护分析柱的。想要清洗它们接柱子就要弄坏了。如果是分析柱堵了，最好是清理一下。但是最好的挽救是预防，考虑加个柱前过滤器，最好加个保护柱。如果问题来自样品 ,就要把样品过滤，或者用固相萃取除掉污染物。如果有备用的柱子滤片，换掉柱头进口的滤片。没有就把它拿下来 , 它的填料是有内压的,你一拿开滤片填料就会泄漏出来。这时如果手头有备用的滤片，就要快速的更换并重新封好柱子,如果没有就不要开聚合柱。如果更换或清洗后压力没有降低,那么可

14、能是有东西吸附在填料表面或者渗透到了柱子中间了.这时就要用能溶解或解吸收潜在污染物的完成这个工作的.对反相柱来说，可以采取如下程序:水，甲醇,THF，水，甲醇,二氯甲烷。如果还是没用,可以考虑反向冲洗柱子。但是到了这个时候最好拿起电话去订购一根新柱子.柱子污染问：我的柱子的寿命不是很长.进了大概 500 针之后，峰就变宽了，还有拖尾。以前的柱子都能进1000针左右,这根柱子哪里有问题？答：很有可能这根柱子啥问题都没有。在我们详细讨论之前 ,我先问你一个问题，你用了保护柱没有?问：没有，但是我用了柱前过滤器。这也可以保护柱子,不是吗？答:很不幸，柱前过滤器只能起到部分的保护作用。他们能够除去流部

15、分情况下这些颗粒来自于样品.你的样品是什么？问:是固相萃取后的血浆。我承认血浆的组分会使柱子寿命迅速降低，但是我的色谱图很干净，背景干扰很小。更重要的是，以前我们能够进 1000针，只是现在的污染速度更快了.答:在很多情况下,样品的配制过程不是 100的完美。毕竟，还是有一些干扰出现在你的色谱图中。同样，尽管你很小心的配制，但是还集在柱头.另外,背景污染物的浓度会因样品而改变，因此在我看来，柱子寿命因一个或两个原因而减少了是正常的.我的建议是使用保护柱来保护你的柱子。因此我认为加保护柱不是一个好方法。样填料的保护柱.这样相当于把你的分析柱延长了，而污染物则被保护柱而不是分析柱所吸附.如果填料装

16、的好，对分离效果的影响是微乎其微的.有些情况可能还会更好一点。但这不是重点，重点是我们保护了分析柱。如果选用与分析柱填料不一样的保护柱,你就会看到峰形变差。另外，样导致的。所以，最好还是选用填料一致的分析柱和保护柱 .可以保证你得到最好的保护和最小的峰形失真.问：问题是保护柱很贵。说说柱子的再生和冲洗过程？答：我通常把柱子再生作为最后的选项，除非没有其他选择。再生问并不了解只能猜测柱子的污染物。另外，有时候污染物很难清除掉 .你的问题就是这样的例子。我推测污染物是一些细小的蛋白质 .建立洗程序，但是不一定对你有帮助。在这些程序中，你要用一系列的溶剂冲洗柱子，这些溶剂可能会除去污染物.这样花费相

17、当长的时间,并且不一定奏效.上的污染物。他们也不是那么的贵:只有分析柱的一小部分。只需几是明显的,同时心情也好。如果你按照上面说的规则做，可以保证你工作的效率，避免很多头疼的事情色谱柱使用寿命问:我的色谱柱进样大概 100 针后峰形变差了 ,踏板数很低,怎么回事？答:100 针确实很少，一般情况下使用时间会长很多的.首先我们要确认你的使用条件是不是导致色谱柱寿命下降的原因。两种基本情况：1 在相同实验中以前使用的色谱柱寿命长很多2 在本实验中用过的所有的色谱柱在使用相同次数后全部损坏如果是第一种情况,应该检查一下实验是否保持一致。样品的组成改而影响样品的分布。如果可以确认色谱条件没有变化，那么

18、可以推测是柱床松动的原因。柱有没有掉到地上?）或者也有可能使生产商的问题.而且这种问题标出来。这种情况生产商会免费替换色谱柱.问：那些生产商真好,但是我的情况不是这样的。我的色谱柱总是用 100 针，有时候200 针还可以忍受，但是100 针太差了。色谱柱开销太大了，我该怎么办？什么。最大可能是样品中的成分吸附在色谱柱的顶端.可能是在流动相中不柱顶端累积，阻止样品正常吸附和扩散。从而导致峰形变差。通常这种问题和柱压升高同时出现。问：嗯，可能就是这个原因.我应该怎么避免这种问题呢?分析柱相似的固相萃取柱进行固相萃取（SPE：solid phaseextraction）1 效果很好.谱柱前使用的,出现问题的时候就会被替换掉。为了获得最好的分析效果,保护柱的填料和装填技术必须和分析柱一样。如果用不同品牌号,大的颗粒或装填不好的预柱会因谱带扩展而导致分离效果变