食品安全国家标准 食品中赭曲霉毒素A的测定

1、 食品安全国家标准食品中赭曲霉毒素A的测定范围本标准规定了食品中赭曲霉毒素A的测定方法。本标准第一法适用于粮食和粮食制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品中赭曲霉毒素A含量的测定，第二法适用于小麦、玉米和稻谷中赭曲霉毒素A的测定，第三法适用于粮食和粮食制品、酒类、酱油、醋、酱及酱制品中赭曲霉毒素A含量的测定，第四法适用于小麦、玉米和大豆中赭曲霉毒素A的测定。第五法适用于玉米、小麦、大麦、大米、大豆及其的制品中赭曲霉毒素A的测定。第一法 免疫亲和层析净化液相色谱法原理及依据用提取液提取试样中的赭曲霉毒素A，经免疫亲和柱净化后，用高效液相色谱荧光检测器测定，外标法定量。本法以GB/T 23502-200

2、9 食品中赭曲霉毒素A的测定 免疫亲和层析净化高效色谱方法为基础，补充添加SN/T 1940-2007 进出口食品中赭曲霉毒素A的测定方法、GB/T 25220-2010 粮油检验 粮食中赭曲霉毒素A的测定 高效液相色谱法和荧光光度法和SN/T 1746-2006进出口大豆、油菜籽和食用植物油中赭曲霉毒素A的检验方法。试剂和材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，实验用水为GB/T 6682规定的二级水。3.1 试剂3.1.1 甲醇（CH3OH）：色谱纯。3.1.2 乙腈（CH3CN）：色谱纯。3.1.3 冰乙酸（C2H4O2）：色谱纯。3.1.4 氯化钠（NaCl）：分析纯。3.1.5

3、 聚乙二醇（HOCH2（CH2OCH2）nCH2OH）：分析纯。3.1.6 吐温-20（Tween-20）：分析纯。3.1.7 碳酸氢钠；分析纯。3.1.8 磷酸二氢钾：分析纯。3.1.9 浓盐酸。3.2 试剂配制3.2.1 提取液1：甲醇+水（80+20），80份甲醇和20份水混合而成。3.2.2 提取液2：称取150 g氯化钠、20 g碳酸氢钠溶于约950 mL水中，加水定容至1 L。3.2.3 提取液3：乙腈+水（60:40），60份乙腈和40份水混合而成。3.2.4 冲洗液：称取25 g氯化钠、5 g碳酸氢钠溶于约950 mL水中，加水定容至1 L。3.2.5 真菌毒素清洗缓冲液：称取

4、25.0 g氯化钠、5.0 g碳酸氢钠溶于水中，加入0.1 mL吐温-20，用水稀释至1 L。3.2.6 磷酸盐缓冲液：8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾溶解于约990mL水中，用浓盐水调节pH至7.0，用水稀释至1L。3.2.7 碳酸氢钠溶液（10g/L）：称取1g碳酸氢钠，用水溶解并稀释到100mL。3.2.8 淋洗缓冲液：在100mL磷酸盐缓冲液中加入1.0mL吐温-20。3.3 标准品赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）标准品：纯度98%。3.4 标准溶液配制3.4.1 OTA标准储备液（0.1 mg/mL）：准确称取一定量的OTA标准品，

5、用甲醇-乙腈（1:1，v/v）溶解，配成0.1 mg/mL的标准储备液，在-20 保存，可使用3个月。3.4.2 OTA标准工作液：根据使用需要，准确吸取一定量的OTA储备液，用流动相稀释，分别配成相当于1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL的标准工作液，4 保存，可使用7天。3.5 材料3.5.1 OTA免疫亲和柱。3.5.2 槽纹折叠滤纸，无荧光特性。3.5.3 玻璃纤维滤纸：直径11 cm，孔径1.5 m，无荧光特性。仪器和设备4.1 天平：感量0.001 g。4.2 高效液相色谱仪：配有荧光检测器。4.3 均质器：转速大于10 000 r/

6、min。4.4 高速万能粉碎机：转速10 000 r/min。4.5 玻璃注射器：10 mL。4.6 试验筛：1 mm孔径。4.7 空气压力泵。4.8 超声波发生器：功率大于180 W。分析步骤5.1 试样制备与提取5.1.1 谷物、油料及其制品5.1.1.1粮食和粮食制品：颗粒状样品需全部粉碎通过试验筛（4.6），混匀后备用。提取方法1：称取25g试样（m，精确到1mg），加入100.0 mL乙腈+水（60+40）溶液（3.2.3），高速均质3min或振荡30min（振荡频率150 rpm），槽纹折叠滤纸（3.5.2）过滤，取4.0mL滤液加入26.0 mL磷酸盐缓冲液（3.2.6）混合均匀

7、，混匀后高速离心机（4.4）离心5min（转速8000rpm），上清作为滤液A备用。提取方法2：称取25g试样（m，精确到1mg），加入100.0 mL甲醇+水（80+20）溶液（3.2.1），高速均质3min或振荡30min（振荡频率150 rpm），槽纹折叠滤纸（3.5.2）过滤，准确量取10.0mL滤液，然后加40mL磷酸盐缓冲液（3.2.6）稀释至50.0mL，混合均匀，经玻璃纤维滤纸（3.5.3）过滤，滤液B收集于干净容器中，备用。5.1.1.2 大豆、油菜籽、食用植物油：准确称取试样50.0g（准确到0.1g）（大豆需要磨细且粒度2mm）于均质器配置的搅拌钵中，加入5.0g氯化钠及

8、100mL甲醇（适用于油菜籽）或100mL甲醇+水（8+2）溶液（3.2.1），以均质器高速搅拌提取1min。以横纹折叠滤纸（3.5.2）过滤，准确移取10.0mL滤液并加入40.0mL水稀释，用玻璃纤维滤纸（3.5.3）过滤，滤液C收集于干净容器中，备用。5.1.2 酒类：取脱气酒类试样（含二氧化碳的酒类样品使用前先置于4 冰箱冷藏30 min，过滤或超声脱气）或其他不含二氧化碳的酒类试样20 g（精确到0.01 g），置于25 mL容量瓶中，加提取液2（3.2.2）定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸（3.5.3）过滤至滤液澄清，滤液D收集于干净容器中，备用。5.1.3 酱油、醋、酱及酱制品：

9、称取25 g（精确到0.01 g）混匀的试样，用提取液1（3.2.1）定容至50.0 mL，超声提取5 min。横纹折叠滤纸（3.5.2）过滤，移取10.0 mL滤液于50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸（3.5.3）过滤至滤液澄清，滤液E收集于干净容器中，备用。5.1.4 葡萄干：称取粉碎试样50g（准确到0.1g）于均质器配置的搅拌杯中，加入100mL碳酸氢钠溶液（3.2.7），将搅拌杯置于均质器上，于22000r/min高速搅拌提取1min。提取液经横纹折叠滤纸（3.5.2）过滤。准确移取10mL滤液并加入40mL淋洗缓冲液（3.2.8）稀释，经玻璃纤维滤纸（3.5.

10、3）过滤至滤液澄清，滤液F收集于干净容器中，备用。5.1.5 胡椒粒/粉：称取混匀试样25g（准确到0.1g）于均质器配置的搅拌杯中，加入100mL碳酸氢钠溶液（3.2.7），将搅拌杯置于均质器上，以22000r/min高速搅拌提取1min。将提取物置于200mL离心杯中于4000r/min离心15min。准确移取20mL滤液并加入30mL淋洗缓冲液（3.2.8）稀释，经玻璃纤维滤纸（3.5.3）过滤至滤液澄清，滤液G收集于干净容器中，备用。5.2 净化 5.2.1 谷物、油料及其制品5.2.1.1 粮食和粮食制品：将免疫亲和柱连接于玻璃注射器（4.5）下，准确移取5.1.1.1提取方法1中全

11、部滤液A或提取方法2中20 mL滤液B，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1 滴/S的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，依次用10 mL 真菌毒素清洗缓冲液（3.2.4）、10 mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速约为1 滴/S2 滴/S，弃去全部流出液，抽干小柱。5.2.1.2 大豆、油菜籽、食用植物油: 将免疫亲和柱连接于玻璃注射器（4.5）下，准确移取10mL滤液C，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1 滴/S的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，依次用10 mL 真菌毒素清洗缓冲液（3.2.5）、10 mL

12、水先后淋洗免疫亲和柱，流速约为1 滴/S2 滴/S，弃去全部流出液，抽干小柱。5.2.2 酒类：将免疫亲和柱连接于玻璃注射器（4.5）下，准确移取滤液D 10.0 mL，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1 滴/S的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，依次用10 mL冲洗液（3.2.4）、10 mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速约为1 滴/S2 滴/S，弃去全部流出液，抽干小柱。5.2.3 酱油、醋、酱及酱制品中：将免疫亲和柱连接于玻璃注射器（4.5）下，准确移取滤液E 10.0 mL，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约

13、1 滴/S的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，依次用10 mL 真菌毒素清洗缓冲液（3.2.5）、10 mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速约为1 滴/S2 滴/S，弃去全部流出液，抽干小柱。5.2.4 葡萄干：将免疫亲和柱连接于玻璃注射器（4.5）下，准确移取滤液F 10.0 mL，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1 滴/S的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，依次用10 mL 真菌毒素清洗缓冲液（3.2.5）、10 mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速约为1 滴/S2 滴/S，弃去全部流出液，抽干小柱。5.2.5 胡椒粒/粉：将免疫亲和柱连接于玻璃注

14、射器（4.5）下，准确移取滤液G 10.0 mL，注入玻璃注射器中。将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力，使溶液以约1 滴/S的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中，依次用10 mL 真菌毒素清洗缓冲液（3.2.5）、10 mL水先后淋洗免疫亲和柱，流速约为1 滴/S2 滴/S，弃去全部流出液，抽干小柱。5.3 洗脱准确加入1.5 mL甲醇或免疫亲和柱厂家推荐的洗脱液进行洗脱，流速约为1 滴/S，收集全部洗脱液于干净的玻璃试管中，在45下以氮吹仪用氮气吹干。用液相流动相溶解残渣并定溶到500L，即为试样提取净化液，供高效液相色谱测定时使用。5.4 高效液相色谱参考条件色谱柱：C18柱，

15、粒径5 m，150 mm4.6 mm 或相当者；流动相：乙腈+水+冰乙酸（96+102+2）；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ；进样量：50 L；检测波长：激发波长333 nm，发射波长460 nm。5.5 定量测定以OTA标准工作液浓度为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对试样进行定量，标准工作溶液和试样溶液中OTA的响应值均应在仪器检测线性范围内。在上述色谱条件下，OTA标准品色谱图参见图 A.1。5.6 空白试验除不加试样外，空白试验应与测定平行进行，并采用相同的分析步骤。5.7 平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。分析结果的表述试样中O

16、TA的含量按式（2）计算： （2）式中：X 试样中OTA的含量，单位为微克每千克（g/kg）；c1试样溶液中OTA的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；c0空白试样溶液中OTA的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V试样测定液最终定容体积，单位为毫升（mL）；m试样的质量，单位为克（g）；f稀释倍数。检测结果以两次测定值的算数平均值表示。计算结果表示到小数点后1位。精密度7.1 实验室间测试附录B中表B.1、B.8对应统计了方法一、方法四精密度的实验室间测试数据，这些结果适用于本分析浓度范围和基体之内的样品。7.2 重复性在同一实验室，由同一操作者使用相同设备，按相同的测试方法，并在短时间

17、内对同一被测试对象相互独立进行测试获得的两次独立测试结果的绝对差值大于表B.1（方法一）、表B.8（方法四）所示重复性限值（r）的情况不超过5%。7.3 再现性在不同的实验室，由不同的操作者使用不同的设备，按相同的测试方法，对同一被测对象相互独立进行测试获得的两次独立测试结果的绝对差值大于表B.1（方法一）、表B.8（方法四）所示再现性限值（R）的情况不超过5%。8 其他本方法定量限小于1 g/kg。第二法 离子交换固相萃取柱净化高效液相色谱法9 原理 试样中的赭曲霉毒素A用溶剂提取，提取液经固相萃取柱净化、洗脱后，用高效液相色谱荧光检测器测定，外标法定量。10 试剂和材料 除非另有说明，本方

18、法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水要求。10.1 试剂10.1.1 乙腈（CH3CN）：色谱纯。10.1.2 甲醇（CH3OH）：色谱纯。10.1.3 冰醋酸（C2H4O2）。10.1.4 石油醚（60 90 ）。10.1.5 甲酸（CH2O2）。10.1.6 三氯甲烷（CHCl3）。10.1.7 碳酸氢钠 （NaHCO）。10.1.8 磷酸（H3PO4）。10.2 试剂配制 10.2.1 氢氧化钾溶液（0.1 mol/L）：称取氢氧化钠0.56 g，溶于100 mL水，混匀。10.2.2 磷酸水溶液（0.1 mol/L）：移取0.68mL磷酸，溶于100 mL水，混匀。

19、102.3 碳酸氢钠溶液（30g/L）：称取碳酸氢钠30.00 g，溶于1000 mL水，混匀。10.2.4 乙酸水溶液（2%，体积比）：量取20 mL冰醋酸，溶于980mL水，混匀。 10.2.5 提取液：氢氧化钾溶液（0.1 mol/L）+甲醇+水=2+60+38。10.2.6 淋洗液：氢氧化钾溶液（0.1 mol/L）+乙腈+水=3+50+47。10.2.7 洗脱液：甲醇+乙腈+甲酸+水=40+50+5+5。10.2.8 甲醇-碳酸氢钠溶液（50+50）：量取500 mL甲醇，500 mL碳酸氢钠溶液（10.2.3），混匀。10.2.9 乙腈-乙酸溶液：分别量取50mL乙腈，50mL乙酸

20、水溶液（10.2.4），混匀。10.3 标准品 赭曲霉毒素 A（Ochratoxin A，OTA）标准品:纯度99%。10.4 标准溶液配制10.4.1 赭曲霉毒素A标准储备溶液（100g /mL）：准确移取一定量的赭曲霉毒素A标准品，用甲醇溶解配制成100g /mL的标准储备液，避光保存于4 冰箱备用。10.4.2 赭曲霉毒素A标准工作溶液（1g /mL）：准确称取一定量的赭曲霉毒素A标准储备液（10.4.1） ，用甲醇溶解配制成1g /mL的标准储备液，避光保存于4 冰箱备用。10.4.3 赭曲霉毒素A系列标准工作溶液:准确移取适量赭曲霉毒素A标准工作液（10.4.2），用甲醇稀释配制成1

21、ng/mL、2.5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL 的系列标准工作溶液。11 仪器和设备 11.1 高效液相色谱仪：带荧光检测器。11.2 分析天平: 感量0.1 mg。 11.3 固相萃取柱:高分子聚合物基质阴离子交换柱，200 mg/3 mL。11.4 氮吹仪。11.5 漩涡振荡器。11.6 旋转蒸发仪。11.7 高速万能粉碎机。11.8 20目筛。11.9 有机滤膜：0.45m孔径。11.10 快速定性滤纸。12 操作步骤12.1 试样制备玉米、稻谷（糙米）、小麦、小麦粉、大豆及咖啡豆等用高速万能粉碎机将样品粉碎，用20目筛筛理，筛下物装瓶备用。12.2

22、样品提取12.2.1 玉 米 称取试样10 g（精确至0.01 g），加人三氯甲烷50 mL和5 mL 0.1 mol/L的磷酸溶液（10.2.2）（V1），于漩涡振荡器上振荡提取3 min5 min，提取液用定性滤纸过滤，取下层滤液10mL放入100mL平底烧瓶中，于水浴中40 用旋转蒸发仪旋转蒸发至接近干涸，用20 mL石油醚溶解残渣，加入10 mL提取液（10.2.5），再用漩涡振荡器振荡提取3 min5 min，静置分层后取下层溶液，用滤纸过滤，取滤液5 mL（V2）进行固相萃取。12.2.2 稻谷（糙米）、小麦、小麦粉、大豆 称取试样10 g（精确至0.01 g），加人提取液50 m

23、L（V1）（10.2.5），于漩涡振荡器上振荡提取3 min5 min，用定性滤纸过滤，取滤液10 mL放人100 mL平底烧瓶中，加人20 mL石油醚，漩涡振荡器振荡提取3 min5 min，静置分层后取下层溶液，用滤纸过滤，取滤液5 mL（V2）进行固相萃取净化。12.2.3 咖 啡称取样品2.5 g（精确至0.01 g）， 于50 mL聚丙烯锥形试管（带盖）中， 加入25mL甲醇-碳酸氢钠溶液（10.2.8） （V1）于漩涡振荡器提取3 min5 min， 以4 000 r/ min离心10 min，上清液用滤纸过滤后， 取滤液10mL进行固相萃取净化（V2）。12.2.4 葡萄酒准确移

24、取葡萄酒样10mL（V1）于烧杯中，加入6mL提取液（10.2.5），混匀，再用氢氧化钾溶液（10.2.1）调pH至约910进行固相萃取净化。 12.3 固相萃取净化 分别用5 mL甲醇、3 mL提取液（10.2.5）活化固相萃取柱，然后将11.2制备的样品提取液加入固相萃取柱，调节流速以1 滴/s2 滴/s的速度通过柱子，分别依次用3 mL淋洗液（10.2.6）、3mL水、3 ml甲醇淋洗柱，抽干，最后用5 mL洗脱液（10.2.7）洗脱并收集洗脱液于玻璃试管中，于45 下氮气吹干溶剂，用1.0 mL乙腈-乙酸溶液（ 10.2.9）溶解（V3），过滤后备用。12.4 高效液相色谱参考条件 1

25、2.4.1色谱柱：C18柱， （150 mm4.6 mm，5m） 或性能相当者。12.4.2激发波长：333nm；发射波长：460nm。12.4.3柱温：30。12.4.4进样量：10L 50L 。12.4.5流速：1 mL/min 。12.4.6流动相：A：冰乙酸水溶液（2%，体积比）， B：乙腈。12.4.7等度洗脱程序：A+B=50+50。12.4.8 梯度洗脱程序：梯度洗脱条件见表1。表1: 梯度洗脱条件时间/（min）流动相A/（%）流动相B /（%）088122881210802012703019505030505031010039010040881245881212.5 标准曲线

26、的制作将赭曲霉毒素A系列标准工作溶液（10.4.3），注入高效液相色谱仪中，按照12.4 参考色谱条件（咖啡和葡萄酒样品测定采用梯度洗脱程序，其他样品采用等度洗脱程序） ，测定赭曲霉毒素A的峰面积。以系列标准工作溶液的浓度为横坐标，以相应的峰面积（或峰高）为横坐标，绘制标准曲线。12.6 试样溶液的测定 将12.2制备的试样溶液，注入高效液相色谱仪中，按照12.4 参考色谱条件（咖啡和葡萄酒样品测定采用梯度洗脱程序，其他样品采用等度洗脱程序），测定赭曲霉毒素A的峰面积，根据标准曲线计算得到待测液中赭曲霉毒素A的浓度。13 分析结果的表述试样中赭曲霉毒素A的含量按式（5）计算： （5） （6）式

27、中：X1=固体试样中赭曲霉毒素A的含量，单位为微克每千克（g/kg）；X2=液体试样中赭曲霉毒素A的含量，单位为微克每千克（gL）； c=从标准曲线上获得的赭曲霉毒素A的含量，单位为微克每升（ng/mL）； m=试样质量，单位为克（g）V1= 试样总提取液体积，单位为毫升（mL）；V2= 用于固相萃取的样品提取液体积，单位为毫升（mL）；V3=氮吹后试样的定容体积，单位为毫升（mL）；V4= 液体试样取样体积，单位为毫升（mL）；1000=单位换算常数。 计算结果以重复性条件下获得的两次独立测XX果的算术平均值表示，结果至小数点后两位。14 精密度 在重复性条件下获得两次独立测XX果的绝对差值

28、不得超过算术平均值的15% 。15 其他 葡萄酒检出限0.04 g/L，定量限 0.13g/L，其他样品的检出限0.3g/kg，定量限 1.0g/kg。第三法 免疫亲和层析净化液相色谱-串联质谱法16 原理用提取液提取试样中的赭曲霉毒素A，经免疫亲和柱净化后，用液相色谱-串联质谱测定，外标法定量。17 试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。17.1 试剂17.1.1 甲醇（CH3OH）：色谱纯。17.1.2 乙腈（CH3CN）：色谱纯。17.1.3 甲酸（HCOOH）：色谱纯。17.1.4 甲酸铵（HCOONH4）：色谱纯。17.1.5 氯化钠（

29、NaCl）：分析纯。17.1.6 碳酸氢钠（NaHCO3）：分析纯。17.2 试剂配制17.2.1 提取液1：甲醇+水（80+20），80份甲醇和20份水混合而成。17.2.2 提取液2：称取150 g氯化钠、20 g碳酸氢钠溶于约950 mL水中，加水定容至1 L。17.2.3 磷酸盐缓冲液：8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾溶解于约990mL水中，用浓盐水调节pH至7.0，用水稀释至1L。17.2.4 定容溶液：乙腈+水（35+65），35份乙腈和65份水混合而成。17.3 标准品赭曲霉毒素A标准品：纯度98%。17.4 标准溶液配制17.4.1 赭曲霉毒

30、素A标准储备液（0.1 mg/mL）：准确称取一定量的赭曲霉毒素A标准品，用甲醇-乙腈（1:1，v/v）溶解，配成0.1 mg/mL的标准储备液，在-20 保存，可使用3个月。17.4.2 赭曲霉毒素A标准工作液：根据使用需要，准确吸取一定量的赭曲霉毒素A储备液，用流动相稀释，分别配成相当于1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL的标准工作液，4 保存，可使用7天。17.5 材料17.5.1 赭曲霉毒素A免疫亲和柱。17.5.2 玻璃纤维滤纸：直径11 cm，孔径1.5 m，无荧光特性。18 仪器和设备18.1 天平：感量0.001 g。18.2 液

31、相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾电离源。18.3 免疫亲和萃取装置。18.4 涡旋振荡器。18.5 氮吹仪。18.6 高速均质器：转速大于10 000 r/min。18.7 样品粉碎机。19 分析步骤19.1 试样制备与提取19.1.1 玉米、小麦等粮食产品：将样品粉碎，称取25 g试样，加入5 g氯化钠，用80 %甲醇水溶液定容至100 mL，混匀，高速均质提取2 min。定量滤纸过滤，移取10 mL滤液于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液A于干净的容器中。19.1.2 辣椒及其制品等：将样品粉碎，称取25 g试样，加入5 g氯化钠，用80 %甲醇

32、水溶液定容至100 mL，混匀，高速均质提取2 min。定量滤纸过滤，移取10 mL滤液于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液A于干净的容器中。19.1.3 啤酒等酒类：取脱气酒类试样（含二氧化碳的酒类样品使用前先置于4 冰箱冷藏30 min，过滤或超声脱气）或其他不含二氧化碳的酒类试样25 g，加50 mL提取液（15 %氯化钠，2 %碳酸氢钠），混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液B于干净的容器中。19.1.4 酱油等产品：称取25 g混匀的试样，用80 %甲醇水溶液定容至50.0mL，超声提取5min。定量滤纸过滤，移取10 mL滤液于

33、50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，收集滤液C于干净的容器中。19.2 净化19.2.1 玉米、小麦等粮食产品：准确移取滤液A 10 mL，注人玻璃注射器中，使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，依次用10mL PBS缓冲液、10mL水淋洗免疫亲和柱，流速约为1滴/s2滴/s，弃去全部流出液，抽干小柱。19.1.2 辣椒及其制品等：准确移取滤液A 10 mL，注人玻璃注射器中，使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，依次用10mL PBS缓冲液、10mL水淋洗免疫亲和柱，流速约为1滴/s2滴/s，弃去全部流出液，抽干小柱。19.2.3 啤酒等酒类：准确移取

34、滤液B 10 mL，注入玻璃注射器中，使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，依次用10mL PBS缓冲液、10 mL水淋洗免疫亲和柱，流速约为1滴/s2滴/s，弃去全部流出液，抽干小柱。19.2.4 酱油等产品：准确移取滤液C 10 mL，注人玻璃注射器中，使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，依次用10mL PBS缓冲液、10mL水淋洗免疫亲和柱，流速约为l滴/s2滴/s，弃去全部流出液，抽干小柱。19.3 洗脱准确加入5 mL甲醇洗脱，流速约为1滴/s，收集全部洗脱液于干净的玻璃试管中，氮气吹干，以35 %乙腈水溶液定容至1mL，供液相色谱-串联质谱测定。（玉米、小麦、挂面、辣椒及其制

35、品等稀释1倍，啤酒等酒类浓缩5倍，酱油等产品等倍）19.4 仪器参考条件19.4.1 液相色谱参考条件色谱柱：Merk LiChroCART 125-2 RP-18e，填料粒径5 m，或同等性能的色谱柱。流动相：A液，水溶液（含有0.1 %甲酸，5 mmol甲酸铵）；B液，95 %乙腈水溶液（含有0.1 %甲酸，5 mmol甲酸铵）。梯度洗脱参见表2。柱温：30。进样量：20 L。表2流动相时间梯度时间流速L/minA%B%03006535230059573005957.1300653515300653519.4.2 质谱参考条件离子化方式：电喷雾电离。扫描方式：负离子扫描。检测方式：多反应监

36、测（MRM）。离子源电压：5500。离子源温度：650 。雾化气、气帘气、碰撞气、辅助加热气均为高纯氮气，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要求。多反应监测（MRM）参数详见表3。表3 MRM参数赭曲霉毒素A母离子（m/z）子离子（m/z）采集时间（ms）去簇电压（V）碰撞能量（V）赭曲霉毒素A402.1358.1*200-82-28166.9200-68-47*为定量子离子19.5 液相色谱-串联质谱测定定性测定试样中赭曲霉毒素A色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰保留时间相比较，变化范围应在2.5%之内。每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测

37、批次，对同一种化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液比，其允许偏差不超过表2规定的范围。表2 定性时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度50%20%至50%10%至20%10%允许相对偏差20%25%30%50%目标化合物以保留时间和两对离子（特征离子对/定量离子对）所对应的LC-MS/MS色谱峰面积相对丰度进行定性。要求被测试样品中目标化合物的保留时间与标准溶液中目标化合物的保留时间一致（一致的条件是偏差小于20%），同时要求被测试样品中目标化合物的两对离子对应LC-MS/MS色谱峰面积比与标准溶液中目标化合物的面积比一致。定量测定配置系列基质标准工作溶液分别

38、进样，绘制标准工作曲线。检查仪器性能，确定线性范围。样品溶液中赭曲霉毒素A的响应值应在工作曲线范围内。标准品的液相色谱-串联质谱色谱图参见附录A中的图A.2。19.5.3方法检测限19.5.3.1 赭曲霉毒素A的定性离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于3（S/N3），定量离子的重构离子色谱峰的信噪比应大于等于10（S/N10）。19.5.3.2 玉米、小麦等粮食产品检测限为1.0 g/kg，辣椒及其制品等检测限为1.0 g/kg，啤酒等酒类检测限为0.1 g/kg，酱油等产品检测限为0.5 g/kg。19.6 平行试验按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。19.7 空白试验除不称取试样外，

39、均按上述步骤同时完成空白试验。20 结果计算赭曲霉毒素A的测定按式（1）计算：（1）式中：X试样中被测物残留量，单位为微克每千克（g/kg）；cs基质标准工作溶液中被测物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；A试样溶液中被测物的色谱峰面积；As基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积；V样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；m试样溶液中代表试样的质量，单位为克（g）。第四法 免疫亲和柱层析净化荧光光度法21原理试样中的赭曲霉毒素A用提取液提取后，利用抗体与其相应抗原之间的专一性免疫亲和反应，以含有赭曲霉毒素A特异性抗体的免疫亲和层析柱净化提取液，用荧光光度计进行测定。 本法以SN/T 1940-

40、2007的第二法为基础涵盖SN/T 1746-2006的第二法和GB/T 25220-2010的第二法，同时结合本标准中的第一法的提取方法进行撰写。22试剂和材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为重蒸水。22.1 试剂22.1.1 乙腈（CH3CN）：色谱纯。22.1.2 甲醇（CH3OH）：色谱纯。22.1.3 氯化钠（NaCl）。22.1.4 吐温-20。22.1.5 碳酸氢钠（NaHCO3）。22.1.6 硫酸奎宁。22.1.7 浓硫酸（H2SO4）。22.1.8 氢氧化钠（NaOH）。22.2 试剂配制 22.2.1 提取液：甲醇+水=80+20。22.2.2 淋洗缓冲液：

41、25 g氯化钠、5 g碳酸氢钠溶于水中，加人0.1 mL吐温-20，用水稀释至1 L。22.2.3 0.05 mol/L硫酸溶液：量取2.8 mL浓硫酸，缓慢加入适量水中，冷却定容至1 000 mL。22.2.4 0.1 mol/L氢氧化钠溶液：称取0.40 g氢氧化钠，缓慢加入适量水中，冷却后定容至100 mL。22.2.5 甲醇-氢氧化钠溶液：甲醇+氢氧化钠=50+50。22.3 标准溶液的制备22.3.1 准确称取适量的OA标准品，用甲醇-氢氧化钠溶液（22.2.4）溶解并定容，配制成5 mg/mL和10 mg/mL OA标准溶液。22.3.2 荧光光度计标定溶液：准确称取一定量的硫酸奎

42、宁，用硫酸溶液（22.2.3）溶解并稀释至100 mL。分别用5 mg/mL和10 mg/mL OA标准溶液（22.3.1）确定相当于该浓度荧光强度的硫酸奎宁溶液浓度，并用该浓度的硫酸奎宁溶液标定荧光光度计（配制时可参考：1.625 mg/mL硫酸奎宁的荧光强度约相当于1 mg/mL OA，具体根据实际情况定）。此标定溶液浓度一经确定，可在该荧光计上反复使用。23 仪器和设备23.1 荧光光度计：激发波长360 nm、发射波长440 nm。23.2 高速均质器：约22 000 r/min，或性能相当的设备。23.3 槽纹折叠滤纸：无荧光特性。23.4 玻璃纤维滤纸：直径11 cm，孔径1.5

43、m，无荧光特性。23.5 OA免疫亲和柱：对OA的最大吸附容量可达100 ng，对于甲醇+PBS=1+10溶液中含有5 ng OA的回收率不小于85%。 玻璃注射器：10 mL。23.7 空气压力泵。分析步骤24.1 提取同5.1。24.2 净化 同5.2操作至淋洗步骤结束。准确吸取1.5mL 0.1 mol/L氢氧化钠溶液（22.2.4）以1 滴/s2 滴/s的流速洗脱OA，收集全部洗脱液于玻璃试管中。24.3 荧光光度计标定在激发波长360 nm、发射波长440 nm条件下，以0.05 mol/L硫酸溶液为空白，调节荧光光度计的读数值为零，再分别以不同浓度硫酸奎宁标定溶液调节荧光光度计的读

44、数值分别为5和10。24.4 测定在甲醇洗脱液中加入1 mL 0.1 mol/L NaOH溶液（22.2.4），总体积为V（2 mL），混匀后立即置于荧光光度计中，读取溶液的荧光强度，此读数即为试样测定液中OA的浓度（c）。24.5 空白试验除不加试样外，按24.1步骤进行提取、净化、测定，求得空白试液中OA的浓度（c0）。24.6 平行试验每个试样进行两次平行试验，取两次测定的算术平均值作为测XX果。25 分析结果的表述试样中OA的含量按式（4）计算： （4）式中：X2 试样中OA的含量，单位为微克每千克（g/kg）；c最终定容试样提取净化液中OA的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；c0

45、空白试样中最终定容溶液中OA的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V试样测定液最终定容体积，单位为毫升（mL）；m试样质量，单位为克（g）；f稀释倍数。第五法 酶联免疫吸附测定法26 原理 试样中的赭曲霉毒素A（OTA）经甲醇水提取后以抗原-抗体反应为基础进行测定。微孔板上包被有抗抗体，赭曲霉毒素A标准品或样品、酶标抗原和抗体加入后，游离的赭曲霉毒素A与酶标抗原竞争性的与抗体结合，抗体或抗体结合物与固定在微孔板上的抗抗体再结合，没有结合的标准品、酶标抗原及抗体被洗去，加入四甲基联苯胺（TMB）和过氧化氢底物后的反应溶液呈蓝色，加入终止液硫酸（或盐酸）后反应溶液由蓝色变为黄色。酶标仪在450n

46、m处检测，结果吸光值与样品中赭曲霉毒素A含量成负相关，与标准曲线比较即可得出待测样品中赭曲霉毒素A的含量。 27 试剂与材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水要求。27.1 抗抗体：羊抗鼠抗体。27.2包被有抗抗体的微孔板96孔或48 孔）。27.3 提取液：甲醇+水=7：3（体积比）。27.4 标准溶液稀释液：甲醇+水=5：95（体积比）。27.5赭曲霉毒素A系列标准工作液：准确吸取赭曲霉毒素A标准溶液储备液，5%甲醇进行稀释，分别配制成系列标准工作液分别为：0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0g/L。 27.6 OTA抗体溶液：OTA单克隆抗

47、体。27.7 OTA酶标抗原：OTA与辣根过氧化物酶（HRP）偶联物。27.8 氯化钠（NaCl）：分析纯。27.9 氯化钾（KCl）：分析纯。27.10 磷酸二氢钾（KH2PO4）：分析纯。27.11 十二水磷酸氢二钾（Na2HPO412H2O）：分析纯。27.12 吐温-20 （Tween-20）：分析纯。27.13 柠檬酸钠（Na3C6H5O72H2O）：分析纯。27.14 柠檬酸（C6H8O7H2O）：分析纯。27.15 3，3，5，5-四甲基联苯胺（简称TMB） ：分析纯。27.16 过氧化氢（H2O2）：分析纯。27.17 浓硫酸（98%）：分析纯。27.18 10倍浓缩洗涤液：分

48、别称取40.00g NaCl（27.8）、1.00g KCl（27.9）、1.00g KH2PO4（27.10）、14.5g Na2HPO412H2O（27.11）、加入2.5mL Tween-20（27.12），加水溶解后定容到500mL。使用前用水稀释10倍（1份浓缩洗涤液加9份水）。 27.19 OTA稀释缓冲液：分别称取8.00g NaCl（27.8）、0.20g KCl（27.9）、0.20g KH2PO4（27.10）、2.9g的 Na2HPO412H2O（27.11），加水溶解，定容到1000mL。 27.20 柠檬酸缓冲溶液：称取10.15g柠檬酸钠（27.13）、13.76g

49、柠檬酸（27.14），加水溶解后定容到1000mL。 27.21 底物溶液甲：称取0.40gTMB（27.15），柠檬酸缓冲溶液（27.20）溶后定容到1000mL。27.22 底物溶液乙：1.5mL 30%H2O2（27.16），柠檬酸缓冲溶液（27.20）稀释、定容到1000mL。27.23 显色底物溶液：1份底物溶液甲+1份底物溶液乙（体积）的混合溶液。 27.24 反应终止液2mol/L H2SO4：量取22.2mL浓硫酸（98%），缓慢加入到177.8mL水中。 27.25 离心管：50mL、1.5mL。27.26 定性滤纸。27.27 过滤漏斗。28仪器与设备 28.1 酶标测定仪仪：带 450nm、630nm波长和振荡功能。28.2 小型粉碎机。28.3 微量移液器：20-200L单道移液器，100-1000L单道移液器， 50-300L