免疫学检测技术的基本原理课件

1、免疫学检测技术 的基本原理免疫学检测技术的基本原理免疫学检测技术 的基本原理免疫学检测技术的基本原理 免疫学诊断抗原或抗体的检测淋巴细胞的测定免疫学检测方法的应用免疫学检测技术的基本原理 免疫学诊断抗原或抗体的检测淋巴细胞的测定免疫学检测方 目的要求1.掌握：凝集反应、沉淀反应、免疫 标记技术的概念；凝集反应、沉淀 反应、免疫标记技术的常用方法及 实际应用. 2.熟悉：细胞免疫检测法的基本原理 及实际应用;3.了解：其他免疫学检测方法及其应用 免疫学检测技术的基本原理 目的要求1.掌握：凝集反应、沉淀反应、免疫免疫学(一)抗原抗体反应的特点 1.抗原抗体反应的特异性 2.抗原抗体反应的可逆性

2、4.抗原抗体反应的阶段性： 特异性结合阶段、肉眼可见阶段 3.抗原抗体反应的可见性一、抗原抗体结合反应的特点及影响因素 免疫学检测技术的基本原理(一)抗原抗体反应的特点 1.抗原抗体反应的特异性 2.抗原Ab 过剩Ag 过剩比例适当，交联成网络Ag-Ab反应的可见性免疫学检测技术的基本原理Ab 过剩Ag 过剩比例适当，交联成网络Ag-Ab反应的可见（二）抗原抗体反应的影响因素电解质 抗原抗体（等电点pH3-5和pH5-6）在中性或弱碱性条件下带有负电荷，需适当浓度的电解质（如0.85%NaCl）才会结合；温度 通常为37酸碱度 最适pH值在6-8之间。pH值接近等电点时，抗原抗体多带正负电荷相

3、等，由于自身吸引而出现凝集，导致非特异性反应。免疫学检测技术的基本原理（二）抗原抗体反应的影响因素免疫学检测技术的基本原理二、抗原或抗体的体外检测方法免疫学检测技术的基本原理二、抗原或抗体的体外检测方法免疫学检测技术的基本原理1.凝集反应直接凝集反应间接凝集反应 细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成凝集团块称凝集反应。免疫学检测技术的基本原理1.凝集反应直接凝集反应间接凝集反应 细菌、红细胞直接凝集反应的作法及应用玻片法：定性试验,主要用于细菌与人类ABO血型的鉴定。试管法：半定量试验.常用于检测抗体的滴度或效价，临床诊断伤寒或副伤寒所用的肥达氏反应和诊断布氏菌病所用的瑞特试验免疫学检

4、测技术的基本原理直接凝集反应的作法及应用玻片法：定性试验,主要用于细菌与人 1:2稀释待测血清 1:4 1:8 1:16 玻片法试管法直接凝集反应免疫学检测技术的基本原理 1:2稀释待测血清 1:4 间接凝集反应的应用常用的载体颗粒：人O型血红细胞和 聚苯乙烯乳胶颗粒应用：链球菌O抗体的检测实验; 类风湿因子的检测.Coombs试验免疫学检测技术的基本原理 间接凝集反应的应用常用的载体颗粒：人O型血红细胞和 聚苯2.沉淀反应 可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物称沉淀反应。单向免疫扩散免疫比浊法双向免疫扩散免疫电泳 抗原或抗体的检测免疫学检测技术的基本原理2.沉淀反应 可溶性抗原与相应抗体结合

5、后出现沉单向免疫扩散的应用应用：测定血清中IgG、IgM、IgA 与补体C3的含量.缺点:12天才出结果。双向免疫扩散的应用应用：根据沉淀线的数目和形状可对抗原或抗体进行定性检测、组分分析等。免疫学检测技术的基本原理单向免疫扩散的应用应用：测定血清中IgG、IgM、IgA 对流免疫电泳可检测： 血液中的HBsAg和AFP 免疫比浊法主要用于： 血清蛋白及抗体成分的分析研究免疫学检测技术的基本原理对流免疫电泳可检测：免疫比浊法主要用于：免疫学检测技术的3.免疫标记技术 抗原或抗体的检测 用荧光素、酶、同位素等标记抗体或抗原用以测定相应抗原或抗体的技术称为免疫标记技术。特点：敏感、特异、快速，能定

6、性、定量、定位。免疫学检测技术的基本原理3.免疫标记技术 抗原或抗体的检测 用荧光素、酶免疫印迹法免疫胶体金技术 放射免疫测定法免疫荧光技术化学发光免疫技术 免疫标记技术常用方法酶免疫测定法ELISA免疫学检测技术的基本原理免疫印迹法免疫胶体金技术 放射免疫测定法免疫荧光技术(1)酶免疫测定法（ELISA） ： 1971年瑞典学者Engvail和Perlman-nn,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附试验。免疫学检测技术的基本原理(1)酶免疫测定法（ELISA） ：免疫学检测技术的基本原理 抗原或抗体的检

7、测间接法: 常用于检测血清中的抗体。将已知抗原包被于固相载体，加入待检标本，若标本中有相应的抗体，则可与抗原结合，再加入酶标二抗，洗涤后加底物，底物受酶的催化发生化学反应产生有色物质。 免疫学检测技术的基本原理 抗原或抗体的检测间接法:免疫学检测技术的基本原理此法是测定抗体最常用的方法。 间接法已知抗原待测抗体酶标抗体免疫学检测技术的基本原理此法是测定抗体最常用的方法。 间接法已知抗原待测 抗原或抗体的检测双抗体夹心法: 常用于检测标本中的抗原。将已知抗体包被在固相载体上，加入待测标本，使其中的抗原与抗体结合，洗去未结合的抗原，加入已知的酶标抗体与标本中抗原结合，再洗去未结合的酶标抗体，加入底

8、物，底物受酶的催化发生化学反应产生有色物质。 免疫学检测技术的基本原理 抗原或抗体的检测双抗体夹心法:免疫学检测技术的基本原双抗体夹心法抗体待测抗原酶标抗体底物免疫学检测技术的基本原理双抗体夹心法抗体待测抗原酶标抗体底物免疫学检测技术的基本原理BAS-ELISA:可用来检测细菌、病毒、肿瘤细胞表面抗原等。 生物素与抗生物素有极高的亲和力，利用抗生物素为桥梁，联结生物素化的抗体及生物素化过氧化物酶，可获得极高的敏感性（多级放大系统）。 -Ab+待测Ag+ Ab-生物素化+抗生物素（四价）+ 生物素化E+底物免疫学检测技术的基本原理BAS-ELISA:可用来检测细菌、病毒、肿瘤细胞表面抗原等 BA

9、S-ELISA法：敏感性更高。用于抗原、抗体以及DNA、RNA的检测。卵白及某些微生物中的蛋白质免疫学检测技术的基本原理 BAS-ELISA法：敏感性更高。用于抗原、抗体以及DN 抗原或抗体的检测微粒捕获酶免疫分析技术 常用于检测肿瘤标志物(CEA、AFP)性激素、甲状腺素（T3、T4）、HCG等微量可溶性抗原 。将已知抗体致敏的微粒与生物素亲和素酶放大系统结合，最后酶作用于荧光底物，通过检测荧光强度来判断未知抗原的含量。 免疫学检测技术的基本原理 抗原或抗体的检测微粒捕获酶免疫分析技术 免疫学检测磁性微粒子固相：直径2.8微米，粒子小，悬 液类似液相；包被面积大；磁吸引分离方便。免疫学检测技

10、术的基本原理磁性微粒子固相：直径2.8微米，粒子小，悬免疫学检测技术的基 抗原或抗体的检测免疫组化技术：指带显色剂（酶）标记的特异性抗体或抗原在组织细胞原位发生抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原或抗体进行定位、定性、定量检测的技术。 免疫学检测技术的基本原理 抗原或抗体的检测免疫组化技术：指带显色剂（酶）标记的免疫组化技术免疫学检测技术的基本原理免疫组化技术免疫学检测技术的基本原理(2)免疫荧光技术 是用荧光素标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗体的方法。常用的荧光素有异硫氰酸荧光素、藻红蛋白等.免疫学检测技术的基本原理(2)免疫荧光技术免疫学检测技术的基本原理直接荧光法：检测不同的抗

11、原，需要不同的特异性荧光抗体间接荧光法：用一抗与样本中的抗原结合，再用荧光素标记的二抗染色。此方法既可检测抗原又可检测抗体。若查抗原，一抗为已知的；若查抗体，抗原是已知的。一种荧光抗体可用于多种不同抗原的检测免疫学检测技术的基本原理直接荧光法：检测不同的抗原，需要不同的特异性荧光抗体免疫学检(3)放射免疫测定法(RIA）：是用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫测定。将同位素的敏感性与抗原抗体结合的特异性结合起来，具有重复性好、准确性高等优点. 用于激素、药物等微量物质的检测，敏感性可达到pg/ml水平。常用的放射性核素有131I和125I等。免疫学检测技术的基本原理(3)放射免疫测定法(RIA

12、）：是用放射性核素标记抗原或抗体(3)化学发光免疫技术（CLIA）： 将化学发光（如鲁米诺）分析和免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术。 特点：灵敏度高、特异性强 分离简便、自动化分析。免疫学检测技术的基本原理(3)化学发光免疫技术（CLIA）：免疫学检测技术的基本原理（4）免疫胶体金技术（ICS）： 用胶体金颗粒标记抗体或抗原，以检测未知抗原或抗体的方法称免疫胶体金技术。 免疫学检测技术的基本原理（4）免疫胶体金技术（ICS）：免疫学检测技术的基本原理（5）免疫印迹技术 又称Western blotting，是将十二烷基磺酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离得到的蛋白转移到

13、固相载体膜上，再用标记的特异性抗血清或单克隆抗体对蛋白质进行定性及定量分析的技术。敏感性为15ng。免疫学检测技术的基本原理（5）免疫印迹技术免疫学检测技术的基本原理4、蛋白质芯片技术 常用于微生物感染的检测。其原理是将各种蛋白质固定于载体上制成芯片，再用荧光标记抗体与芯片作用，洗去未结合的抗体后，用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术测定芯片上各点荧光强度，以此检测荧光对应的抗体及其相互结合的程度。免疫学检测技术的基本原理4、蛋白质芯片技术免疫学检测技术的基本原理三、免疫细胞的测定人的免疫细胞测定：外周血动物的免疫细胞测定： 外周血、胸腺、脾脏与其他组织。免疫学检测技术的基本原理三、免疫细胞的测定

14、人的免疫细胞测定：外周血动物的免疫细胞测定常用的方法：葡萄糖-泛影葡胺密 度梯度离心法。 外周血单个核细胞的分离 淋巴细胞及其亚群的分离1.免疫吸附分离法:获得不同的T细胞亚群2.免疫磁珠分离法：获得不同表面标志的 活T细胞亚群. 3.免疫磁珠法4.抗原肽-MHC分子四聚体技术 免疫学检测技术的基本原理常用的方法：葡萄糖-泛影葡胺密 外周血单个核细胞的分离 免疫吸附分离法： 将已知抗淋巴细胞表面标志的抗体包被聚苯乙烯培养板，加入淋巴细胞悬液，表达相应细胞表面标志的淋巴细胞可被吸附在培养板上，即可与其他细胞分开。 免疫学检测技术的基本原理免疫吸附分离法：免疫学检测技术的基本原理免疫吸附分离法加入

15、淋巴细胞悬液anti-CD4anti-CD4anti-CD4弃上清免疫学检测技术的基本原理免疫吸附分离法加入淋巴anti-CD4anti-CD4ant免疫磁珠法:应用较广泛 是一种特异性分离所需淋巴细胞的方法。首先将特异性抗体（如抗CD3、抗CD4或抗CD8等）吸附在磁性微珠上，与待测细胞悬液中的相应细胞特异性结合后,再将磁珠结合细胞与未结合磁珠细胞分开，即可获得纯度高的所需细胞。 免疫学检测技术的基本原理免疫磁珠法:应用较广泛免疫学检测技术的基本原理磁珠分离法免疫学检测技术的基本原理磁珠分离法免疫学检测技术的基本原理荧光激活细胞分选仪分离法： （流式细胞术分离法） 是一种集光学、流体力学、电

16、力学和计算机技术于一体，可对细胞进行多参数定量测定和综合分析方法. 定量分析活细胞表面表达的特异分子 免疫细胞分析和细胞计数。 白血病和淋巴瘤的免疫学分型。 细胞周期和细胞凋亡检测。免疫学检测技术的基本原理荧光激活细胞分选仪分离法：免疫学检测技术的基本原理流式细胞术荧光抗体标记混合细胞喷嘴单细胞悬液5000-10000个/秒细胞分选器荧光检测器免疫学检测技术的基本原理流式细胞术荧光抗体标记混合细胞喷嘴单细胞悬液细胞分选器荧光检抗原肽-MHC分子四聚体技术 将特异性抗原肽段、可溶性MHC-类分子重链及2微球蛋白在体外正确折叠，在亲和素存在下构建四聚体，并结合流式细胞仪定量检测外周血及组织中抗原特

17、异性CTL的比率。 免疫学检测技术的基本原理抗原肽-MHC分子四聚体技术免疫学检测技术的基本原理淋巴细胞及其亚群的分离免疫细胞功能测定磁珠分离法免疫吸附分离法流式细胞术肽MHC四聚体技术T细胞功能测定B细胞功能测定细胞因子检测T细胞增殖试验迟发型超敏反应的检测抗体含量测定溶血空斑试验巨噬细胞吞噬试验细胞毒试验吞噬功能测定51Cr释放法乳酸脱氢酶释放法细胞染色法凋亡细胞检测法硝基蓝四氮唑试验生物活性检测法免疫学检测法（三）淋巴细胞功能的测定免疫学检测技术的基本原理淋巴细胞及其亚群的分离免疫细胞磁珠分离法免疫吸附分离法流式细1.T淋巴细胞功能的测定 形态学方法：T淋巴母细胞转化试验. 3H-TdR

18、掺入法:灵敏性高,但有放射污染. MTT法：灵敏性不及3H-TdR掺入法,但 无放射污染.（4）迟发型超敏反应（DTH）的检测 免疫学检测技术的基本原理1.T淋巴细胞功能的测定（4）迟发型超敏反应（DTH）的检测形态学方法：T淋巴母细胞转化试验 T淋巴细胞在体外培养时，在有丝分裂原刺激下,可转化为T淋巴母细胞(体积增大、细胞形态不规则、胞质增多、细胞核松散及出现较多核仁)。通过观察培养细胞的数量，了解其细胞的增殖变化。免疫学检测技术的基本原理形态学方法：T淋巴母细胞转化试验 免疫学检测技术的3H-TdR掺入法: T细胞增殖过程中DNA和RNA合成会增加。在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶核苷(

19、3H-TdR）或125I标记的尿嘧啶核苷（125-UdR），则会被掺入细胞核中。培养结束后收集细胞，用液体闪烁仪测定样本中放射性活性，可反映细胞的增殖水平。 灵敏性高, 有放射污染。免疫学检测技术的基本原理3H-TdR掺入法:免疫学检测技术的基本原理放射性测定3H-TdR丝裂原刺激淋巴细胞转化试验原理示意免疫学检测技术的基本原理放射性测定3H-TdR丝裂原刺激淋巴细胞转化试验原理示意免疫 MTT法：灵敏性不及3H-TdR掺入法 但无放射污染. T细胞增殖时，线粒体中的琥珀酸脱氢酶将MTT还原为紫褐色的甲臜颗粒，该颗粒被随后加入的异丙醇或二甲基亚砜溶解。用酶标仪测定细胞培养上清液中溶解紫褐色甲臜

20、的OD值，即反映细胞的增殖水平。 （ MTT一种噻唑盐，二苯基溴化四唑，淡黄色可溶性物质）。免疫学检测技术的基本原理 MTT法：灵敏性不及3H-TdR掺入法 免疫学检测技迟发型超敏反应（DTH） 体内检测细胞免疫功能的皮试方法原理：被抗原已致敏的机体，再用相同的抗原作皮试可导致迟发型超敏反应， 72小时后局部充血、渗出、红肿和硬结。细胞免疫正常者出现阳性反应，细胞免疫低下者则呈弱阳性或阴性反应。 免疫学检测技术的基本原理迟发型超敏反应（DTH）免疫学检测技术的基本原理常用于检测某些微生物感染免疫学检测技术的基本原理常用于检测某些微生物感染免疫学检测技术的基本原理 2.B淋巴细胞增殖试验 (1)

21、利用前面介绍的抗原抗体检测方法 测定标本中抗体含量。 (2)抗体形成细胞测定试验： 又称溶血空斑形成细胞试验,可 检测产生抗体的B细胞数量。 3.细胞毒试验:是检测CTL、NK等细胞杀伤靶细胞活性的细胞学技术。主要用于肿瘤免疫、移植排斥反应和病毒感染等方面的研究。 免疫学检测技术的基本原理 2.B淋巴细胞增殖试验3.细胞毒试验:是检测CTL、NK等4.吞噬细胞功能测定 显微镜测定法 吞噬率（）=（吞噬细菌的吞噬细胞数 200个吞噬细胞）100 吞噬指数=（200个吞噬细胞中所吞噬的细菌 总数 200个吞噬细菌的吞噬细胞） 100 免疫学检测技术的基本原理4.吞噬细胞功能测定 显微镜测定法免疫学

22、检测技术的基本原5细胞因子的测定 细胞因子的检测有助于了解其在免疫调节中的作用，监测细胞免疫功能。常检测的细胞因子有IL-2、IL-4、IL-10、IFN-等。常用的方法主要有生物活性检测法、ELISA法等。免疫学检测技术的基本原理5细胞因子的测定 免疫学检测技术的基本原理三、免疫学检测的应用（一）协助诊断感染性疾病（三）协助诊断免疫系统疾病（四）进行免疫学监测（二）协助诊断肿瘤免疫学检测技术的基本原理三、免疫学检测的应用（一）协助诊断感染性疾病（三）协助诊断免思考题1.解释名词 凝集反应 沉淀反应 免疫标记技术2.可用哪些方法定量检测血液标本中的抗原？3.可用哪些方法检测组织中的抗原？4.H

23、IV、HBV感染者的诊断和病情监测可用哪些方法?免疫学检测技术的基本原理思考题1.解释名词免疫学检测技术的基本原理凝集反应原理图解（一）免疫学检测技术的基本原理凝集反应原理图解（一）免疫学检测技术的基本原理凝集反应原理图解（二）免疫学检测技术的基本原理凝集反应原理图解（二）免疫学检测技术的基本原理凝集反应原理图解（三）免疫学检测技术的基本原理凝集反应原理图解（三）免疫学检测技术的基本原理 单向琼脂扩散试验免疫学检测技术的基本原理 单向琼脂扩散试验免疫学检测技术的基本原 双向琼脂扩散试验免疫学检测技术的基本原理 双向琼脂扩散试验免疫学检测技术的基免疫电泳(immunoelectrophoresi

24、s)免疫学检测技术的基本原理免疫电泳(immunoelectrophoresis)免疫学 对流免疫电泳免疫学检测技术的基本原理 对流免疫电泳 火箭电泳免疫学检测技术的基本原理 火箭电泳免疫测吸光度抗体抗原免疫复合物的浓度与透射光的衰减呈正相关。免疫比浊法原理免疫学检测技术的基本原理测吸光度抗体抗原免疫复合物的浓度与透射光的衰减呈正相关。免疫 免疫荧光技术免疫学检测技术的基本原理 免疫荧光技术免疫学检测技 酶联免疫吸附试验(ELISA-间接法)免疫学检测技术的基本原理 酶联免疫吸附试验(ELISA-间接法)免疫学检测斑点金免疫层析试验胶体金：氯金酸（HAuCl4）在还原剂的作用下，可聚合成特定大

25、小的金颗粒，因其在静电作用下而呈稳定的胶体状态，故称胶体金。免疫学检测技术的基本原理斑点金免疫层析试验胶体金：氯金酸（HAuCl4）在还原剂的作斑点金免疫层析试验 用胶体金作为标记物来检测抗原或抗体的方法。胶体金颗粒聚集后呈红色，可用于标记多种大分子，如白蛋白、免疫球蛋白、糖蛋白、激素、脂蛋白、植物血凝素、卵白素等。免疫学检测技术的基本原理斑点金免疫层析试验 用胶体金作为标记物来检测抗原或抗体 兔抗鼠IgG鼠抗HCG单抗金标鼠抗HCG单抗尿液浸湿标志线 手持端斑点金免疫层析试验（一）免疫学检测技术的基本原理 兔抗鼠IgG鼠抗HCG单抗金标鼠抗HCG单抗尿液浸湿标志线斑点金免疫层析试验（二）尿样

26、阳性弱阳性阴性无效免疫学检测技术的基本原理斑点金免疫层析试验（二）尿样阳性弱阳性阴性无效免疫学检测技术免疫印迹法图解裂解病毒聚丙酰胺凝胶电泳-+ 95 68 45 12KD电转印至NC膜上置待测血清中，漂洗；加酶标抗抗体，漂洗；加底物 显色120 41 24KD十二烷基磺酸钠SDS免疫学检测技术的基本原理免疫印迹法图解裂解病毒聚丙酰胺凝胶电泳-+ 9 T细胞亚群的检测免疫学检测技术的基本原理 T细胞亚群的检测免疫学检测技术的基本原理抗凝血 分层液 抗凝血血浆 白膜层 红细胞离心淋巴细胞的分离免疫学检测技术的基本原理抗凝血 分层液 抗凝血血浆 白膜层 红细胞离心淋巴细胞的分离 T细胞亚群的检测花

27、环法（一）免疫学检测技术的基本原理 T细胞亚群的检测花环法（一）免疫学检测技术的 T细胞亚群的检测花环法（二）免疫学检测技术的基本原理 T细胞亚群的检测花环法（二）免疫学检测技术的基PHA淋巴母细胞转化试验示意图细胞淋巴母细胞免疫学检测技术的基本原理PHA淋巴母细胞转化试验示意图细胞淋巴母细胞免淋转（标本片）淋巴母细胞免疫学检测技术的基本原理淋转（标本片）淋巴母细胞免疫学检测技术的基本原理淋转（标本片）免疫学检测技术的基本原理淋转（标本片）免疫学检测技术的基本原理淋转（标本片）免疫学检测技术的基本原理淋转（标本片）免疫学检测技术的基本原理操作流程1.制备抗体包被板（试剂盒中所带） 2.加待测标本及对照品；加酶标记物 3.温育，37 30min 4.漂洗（磷酸缓冲盐水） ,20s*5次 5.加底物(四甲基联苯胺)、显色剂(H2O2)37 5min 6.结果测定EEEEEEEE底物系统抗AFP抗体AFP酶标抗体双抗体夹心复合物免疫学检测技术的基本原理操作流程1.制备抗体包被板（试剂盒中所带） 2.加待测标本及4.蛋白质芯片技术免疫学检测技术的基本原理4.蛋白质芯片技术免疫学检测技术的基本原理抗原肽-MHC四聚体分离技术亲和素抗原肽MHC I生物素anti-CD8肽-四聚体肽特异性CD8TCD4T及B非肽特异性CD