亲和纯化的技术

1、关于亲和纯化技术第1页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四2第九章 亲和纯化技术亲和纯化技术（Affinity purification）:利用生物分子间的特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术“亲和力”第2页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四3亲和纯化技术亲和层析(Affinity chromatography) 亲和过滤（膜分离）亲和分配（双水相萃取）亲和反胶团萃取（反胶团萃取）亲和沉淀（沉淀）亲和电泳（电泳）第3页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四4第一节 亲和层析(Affinity Chromatography)第

2、4页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四5亲和层析第5页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四6第一节 亲和层析(Affinity Chromatography)（1）配基固定化：配基与载体偶联，结合成具有特异亲和性的分离介质。（2）吸附样品：亲和层析介质选择性吸附生物活性物质.（3）样品解吸：选择适宜的条件使被吸附物活性物质解吸。 第6页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四7一、亲和层析的原理和特点7利用生物大分子物质具有与某些相应的分子专一性可逆结合的特性而建立的层析技术。 适用于从成份复杂且杂质含量远大于目标物的混合物中提纯目标物

3、。经过一次处理可得到高纯度活性物质 ；特异性强、分离效果好、分离条件温和；亲和吸附剂通用性较差，专用的吸附剂。第7页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四8亲和吸附剂：载体配基在亲和层析中起可逆结合的特异性物质称为配基（Ligand）。与配基结合的层析介质称为载体（Matrix）。第8页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四9配基-底物（Ligand-substance）配基-底物：亲和对特异性好 通用性差第9页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四10梁山伯朱丽叶杨贵妃小龙女祝英台林黛玉崔莺莺Ligand Substance祝英台第10页

4、，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四11酶受体，载体蛋白凝集素抗原，病毒，细胞谷胱甘肽聚（His）融合蛋白，表面具有Cys/Trp残基核酸互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶，核酸结合蛋白金属离子谷胱甘肽-S-转移酶，GST融合蛋白抗体多糖类，糖蛋白，细胞表面受体，细胞激素，维生素底物类似物，抑制剂，辅助因子底物 配基 第11页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四12二、载体（一）、亲和层析对载体的要求：第12页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四13（二）、常用载体 第13页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四141

5、、纤维素纤维素结构紧密、均一性差，不利于大分子的渗入。非特异性吸附力较强，空间位阻。主要用于分离与核酸有关的物质。 第14页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四152、琼脂糖凝胶琼脂糖浓度有2%、4%、6%，商品为Sepharose 2B、4B和6B（Pharmacia）。保持吸附物质活性，能迅速活化并接上各种功能基团，结构疏松孔径大，流速快。Sepharose CL,稳定性明显增加，能在pH314中应用。 第15页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四16 3、葡聚糖凝胶：葡聚糖凝胶孔径太小，偶联配基后，孔径更小，应用受到限制。 第16页，共47页，20

6、22年，5月20日，18点23分，星期四174、聚丙烯酰胺凝胶： Bio-gel P有供化学反应的酰胺基，能制得配基含量较高的亲和柱，适用于亲和势比较低的系统。 pH过高或过低的溶液中酰胺基易水解。第17页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四18 5、多孔玻璃珠：化学与物理稳定性较好，机械强度高。缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质有非特异性吸附，化学活性基团少。第18页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四196、其它载体壳聚糖(Chitosan)甲壳素和壳聚糖壳聚糖是甲壳素N-脱乙酰基的产物第19页，共47页，2022年，5月20日，18点23分

7、，星期四20三 、 亲和配基 第20页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四21（一）、配基的选择 第21页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四22（二）、配基的浓度 对亲和势比较低的系统（KL10-4mol/L），增加配基浓度有利于吸附。配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。可以通过增加亲和柱的长度来提高吸附率。第22页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四23（三）、配基偶联的位置配基固定化时，其不参与亲和结合的部位与载体进行偶联。AMP-Sepharose亲和柱腺嘌呤N6-氨基接到载体上，对脱氢酶和甘油激酶有吸附力。磷酸基接到载体上，

8、对甘油醛-3-磷酸脱氢酶有吸附力。例：第23页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四24（四）、配基分子的大小 选用大分子配基。小分子物质作为配基，载体和配基间插入一个“手臂”以消除空间障碍。第24页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四25四、 载体的活化与偶联 Q:载体在于配基偶联前为什么要“活化”？ A：载体相对“惰性”，不能直接与配基连接（不容易发生化学反应），因此在偶联前（载体与配基对接），需要对载体进行“活化”活化的方式有很多种第25页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四26载体的活化的方式多糖类载体第26页，共47页，202

9、2年，5月20日，18点23分，星期四27聚丙烯酰胺凝胶载体的活化法酰胺基 + 含氮化合物 胺衍生物第27页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四28五、 影响吸附亲和力的几个因素 第28页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四29六、 配基与间隔臂的连接 （一）、含氮配基的连接（二）、含羧基配基的连接（三）、含巯基配基的连接（四）、含醛基、酮基、羟基配基的连接第29页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四30七、 亲和层析的吸附和洗脱 第30页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四31第31页，共47页，2022年，5月

10、20日，18点23分，星期四32（一）、影响吸附的条件 1、亲和吸附剂及配体的性质缓冲液的种类、离子强度、pH、温度和层析流速有关。2、温度升高会使吸附作用减弱。3、流速每小时低于10 ml/cm2。4、上样体积为柱床体积的5%。第32页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四33第33页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四34离子效应 配基与载体-间隔臂的不完全结合，将无关离子基团引入吸附剂。具有离子基团的亲和吸附剂会影响蛋白质的洗脱行为。第34页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四35疏水基团吸附剂疏水性基团与蛋白质结构中的疏水区相互

11、吸引，形成非专一性吸附。疏水基团：（1）长的烃链结构的“手臂”：烃链（2）疏水性配基第35页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四36复合亲和力离子效应作用，又有疏水作用。提高选择性对每一具体系统找出最佳的配给浓度、pH、离子强度和温度。第36页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四37（二）、亲和层析的洗脱第37页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四38非专一性洗脱改变洗脱剂的pH以影响电性基团的解离程度离子强度的分步和梯度变化降低缓冲液极性第38页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四39特殊洗脱断裂方法有：硫酯键用

12、羟胺处理30分钟；偶氮键用连二亚硫酸钠硼酸缓冲液处理；二硫键用巯基乙醇、半胱氨酸、二硫苏糖醇等处理。第39页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四40专一性洗脱竞争性效应正洗脱非竞争性效应不能达到洗脱目的反竞争性效应负洗脱第40页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四41专一性洗脱竞争性效应，即ESI不如EI稳定，增加洗脱剂中I，会使E洗脱下来（正洗脱）。S（固定化配基），E（酶），I（游离配基）第41页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四42专一性洗脱非竞争性效应，即ESI稳定性与EI相同，I的存在不影响E对S的结合，用I不能达到洗脱的目的。S（固定化配基），E（酶），I（游离配基）第42页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四43专一性洗脱反竞争性效应，即ESI比EI稳定，I使E与S结合更紧密。增加了酶与配基的结合力及亲和吸附的选择性将I除去“负洗脱”第43页，共47页，2022年，5月20日，18点23分，星期四44反竞争性效应第44页，共47页，2022年，