齐鲁医学碱性磷酸酶km值测定

1、酶促反应动力学研究方法介绍EXPERIMENT 3 碱性磷酸酶km值测定2021/9/301实验目的学习环境因素对酶促反应速度的影响；学习米氏方程及Km值得测定；测量碱性磷酸酶km值；实验原理 E的反应速度受到环境因素的影响，这些因素包括底物浓度、E浓度、PH、温度、激活剂、抑止剂等2021/9/302（一）米曼氏方程式中间产物 酶促反应模式中间产物学说E + S k1k2k3ESE + P相关E学原理2021/9/3031913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米曼氏方程式( Michaelis equation)。S：底物浓度V： 不同S时的反应速

2、度Vmax：最大反应速度(maximum velocity) m：米氏常数(Michaelis constant) VmaxS Km + S 2021/9/304米曼氏方程式推导基于两个假设：(1) E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速度取决于慢反应即 Vk3ES。(2) S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始阶段，S的浓度可认为不变即SSt。 2021/9/305推导过程稳态：是指ES的生成速度与分解速度相等，即 ES恒定。 K1 (EtES) SK2 ES + K3 ESK2+K3 Km （米氏常数） K1令：则(2)变为: (EtES

3、) S Km ES(2)(EtES)SK2+K3ES K1整理得：2021/9/306当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，即EtES，反应达最大速度VmaxK3ESK3Et (5)ES EtSKm + S(3) 整理得:将(5)代入(4)得米氏方程式：VmaxS Km + S V 将(3)代入(1) 得K3EtS Km + S (4) V2021/9/307当反应速度为最大反应速度一半时 Km值的推导KmS Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。2Km + S Vmax VmaxSVmaxVSKmVmax/2 2021/9/308（二）Km与Vmax的意

4、义 Km值 Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。 意义：a) Km是酶的特征性常数之一；b) Km可近似表示酶对底物的亲和力；c) 同一酶对于不同底物有不同的Km值。 2021/9/309 Vmax定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。意义：Vmax=K3 E如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算 酶的转换数(turnover number)，即动力学常数K3。2021/9/3010定义 当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。意义 可用来比较每单位酶的催化能力。 酶的转换数2021/9/3011（三）m值与max值的测定双倒数作

5、图法(double reciprocal plot) -1/Km 1/Vmax 1/S 1/V VmaxS Km+SV = 林-贝氏(Lineweaver-Burk)方程+ 1/V=KmVmax 1/Vmax 1/S 两边同取倒数 2021/9/3012Hanes作图法S S/V -Km Km/Vm 在林贝氏方程基础上，两边同乘SS/V=Km/Vmax + S/Vmax 2021/9/3013酶浓度对反应速度的影响当SE，酶可被底物饱和的情况下，反应速度与酶浓度成正比。关系式为：V = K3 E0 V E 当SE时，Vmax = k3 E 酶浓度对反应速度的影响 2021/9/3014双重影响

6、温度升高，酶促反应速度升高；由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，从而反应速度降低 。温度对反应速度的影响最适温度 (optimum temperature)：酶促反应速度最快时的环境温度。* 低温的应用酶活性0.51.02.01.50 10 20 30 40 50 60 温度 C 温度对淀粉酶活性的影响 2021/9/3015pH对反应速度的影响最适pH (optimum pH)：酶催化活性最大时的环境pH。0酶活性 pH pH对某些酶活性的影响 胃蛋白酶 淀粉酶 胆碱酯酶 2468102021/9/3016碱性磷酸酶km值的测定 以不同浓度的磷酸苯二钠作为碱性磷酸酶的底物，在最适

7、条件下(pH=10.0，37)，准确反应15min。在碱性条件下产物酚可以与酚试剂作用生成蓝色化合物，该蓝色化合物在650nm波长比色，色泽深浅与光密度成正比。反应式如下： 然后，以吸光度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度，即以吸光度的倒数作纵坐标以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法求出Km值。2021/9/30171酚试剂22.5mmolL磷酸苯二钠基质液 3碱性缓冲液(pH-10.0)4碱性磷酸酶液【试剂】 称取磷酸苯二钠635mg，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，加氯仿数滴以防腐，置于冰箱中可保存1年之久。 称取无水Na2CO3 6.36g和NaHcO3 3

8、.36g，先以适量蒸馏水溶解，再定容至1000ml。称取碱性磷酸酶lmg，加水34ml，置于冰箱可保存5周左右。2021/9/3018操作试剂（ml）1234562.5mM磷酸苯二钠0.20.40.60.81.01.0蒸馏水0.80.60.40.2碱性缓冲液1.01.01.01.01.01.0混匀后，37水浴5min碱性磷酸酶0.10.10.10.10.1混匀后，37水浴15min(准确计时）酚试剂1.01.01.01.01.01.0碱性磷酸酶0.110%碳酸钠3.03.03.03.03.03.0混匀后，37水浴15min,以第6管调0与650nm比色，读取各管A值。2021/9/3019实验数据及结果管号A6501/A650s1/ s12