CML患者CD4+和CD8+T细胞的TCR Vβ基因谱系和克隆性

1、CML患者CD4+和CD8+T细胞的TCR V基因谱系和克隆性【关键词】慢性粒细胞白血病t细胞的克隆性trv亚家族基因扫描analysisftrvrepertireandlnalityfd4+andd8+tellsinpatientsithlinstitutefheatlgy,edialllege,jinanuniversity,guangzhu510632，hinakeyrdshrniyelgenusleukeia；tellslnality；trvsubfailies；genesananalysis1材料与方法1.1标本经细胞形态学、细胞组化和细胞及分子遗传学确诊的慢性期l患者19例男12例

2、，女7例，中位年龄26岁1575岁。别离外周血单个核细胞pb，其中部分细胞利用d4、d8单抗iltenyibite,gerany和免疫磁珠分选法as分选d4+和d8+t细胞按产品说明操作。同时搜集14例正常人外周血标本作对照。1.2rna提取和dna合成根据细胞数分别采用trizl试剂盒310610106个和qiagenrneasyinikit3106个提取rna后，应用随机引物和反转录酶试剂盒supersriptii,gib,brl反转录合成dna第一链，按常规方法进展。1.4t细胞克隆性分析2结果正常人外周血d4+和d8+t细胞几乎表达全部24个v亚家族，均呈多克隆性增殖，见图1。l患者那

3、么不同，均选择性表达部分v亚家族，d4+和d8+细胞表达情况比拟类似，见图2。均表达121个v亚家族，以v13的表达率最高18/19例，94.74%，其次为v9，最低的分别为v201/19例，占5.26%和v173/19例，占15.79%。而患者pbs中平均仅表达5.89个v亚家族，2例患者24个v亚家族全部缺失，3例仅表达1个v亚家族，最多者表达14个。基因扫描分析显示73.7%14/19例的l患者d4+细胞亚群有14个亚家族出现不同程度的克隆性增殖t细胞，这些克隆性增殖的t细胞分布在14个亚家族中，以v21克隆性增殖最常见，存在于36.84%7/19例的病人，其它亚家族中克隆性增殖的t细胞

4、多见于12例病人。而在d8+细胞中，不管是出现克隆性增殖t细胞的例数还是不同病例克隆性增殖t细胞分布的亚家族数都较d4+增多，见图3。89.5%17/19例病人出现多少不等15个亚家族的克隆性t细胞，这些克隆性增殖的t细胞分布于20个v亚家族，以v11的克隆性增殖最常见，见于7例36.84%病人，并且有单克隆性t细胞出现。其中v1、v3、v4、v9、v11、v18和v20的克隆性t细胞仅见于d8+细胞中，而v7的克隆性t细胞仅见于d4+亚群。此外，在l患者即使多克隆表达的亚家族t细胞中，基因扫描图形峰的分布也明显异常，见图4、5。图1正常人外周血部分d4+和d8+t细胞克隆性情况略fig.1a

5、partfperipheralbldd4+andd8+tellslnalityinnralindividuals图2l患者d4+和d8+细胞中trv24个亚家族表达情况略fig.2expressinftrv24subfailiesind4+andd8+ellsfrlpatients图3l患者外周血d4+和d8+t细胞的克隆性增殖情况略fig.3peripheralbldd4+andd8+tellslnalityinlpatients图413例d4+中表达trv21基因的l患者pr产物的基因扫描分析结果略fig.4genesanresultsftrv21geneind4+ellsfr13lpat

6、ientsnte:4,9,10,12and15areliglne；5isliglnetrendeny；1isbilne；thethersareplylne.fig.5genesanresultsftrv11geneind8+ellsfr14lpatientsnte:10isnlne；1isliglne；4,8and11areliglnetrendeny；13and14arebilne；thethersareplylne.3讨论t细胞是执行免疫功能的主要细胞，外周血中90%以上的t细胞为t细胞，tr基来由可变区v、高变区d、结合区j和恒定区4部分基因片段组成。胸腺内t细胞发育过程中v、d和j区进

7、展完全重排而形成具有功能的tr基因。重排过程中v、d和j结合的多样性和n区不同数量核苷酸的随机插入形成一个可变化的区域vndnj，称为互补确定区3pleentaritydeteriningregins3,dr3，使tr链序列呈现高度多样性，不同克隆t细胞的tr重排时dr3长度和碱基序列有所不同，这是tr特异地识别抗原的区域，它决定了tr的特异性。已报道v基因可分为24个亚家族即v124，利用trv亚家族的特异性引物检测dr3的长度可以作为一种特异的方法用于t细胞克隆性分析。通过分析trv的基因谱系和dr3长度和序列，可以准确地分析不同trv亚家族t细胞的基因表达和克隆性,是目前分析t细胞克隆性

8、最为敏感的方法3，4。该方法可以很好地对肿瘤患者外周血t细胞或肿瘤浸润性t细胞tuurinfiltratinglyphyte,tiltrv亚家族的表达和克隆性进展分析，从而深化理解机体的免疫功能和对肿瘤细胞相关抗原的特异性免疫反响情况5。正常情况下，机体未受任何抗原刺激时，tr重排是随机的，其t细胞表现为多家族和多克隆性，但在疾病情况下，特殊的抗原刺激可引起某一个或几个亚家族的tr针对性重排，出现克隆性增殖。本研究发现l患者d4+和d8+细胞均选择性表达121个v亚家族，提示了l患者trv亚家族优势利用的特点。假设与其pbs相比，v亚家族的缺失相对较轻，这种差异可能由于单位数量的pbs中t细胞

9、含量较低，某些表达量较低的亚家族未能检测到，t细胞纯化后检测的灵敏度进步。而d4+与d8+细胞中trv亚家族的利用情况无明显差异，且均以v13的表达率最高，说明l患者外周免疫缺陷的分布在不同t细胞亚群无明显的倾向性。t细胞识别多样性抗原依赖于tr的多样性，即多克隆的t细胞。而在本研究中多数患者的一些v亚家族出现克隆性增殖的t细胞，这很可能是在l抗原或其相关抗原的刺激下产生的具有特异性抗l效应的t细胞克拢因为在体外利用灭活的肿瘤细胞或肿瘤相关抗原多肽等作为特异性抗原诱导正常人t细胞扩增，结果与肿瘤患者所表现的t细胞克隆性增殖情况相似，对原刺激细胞还具有杀伤活性6。而在体内这些克隆性增殖的t细胞未能显示出明显的杀灭白血病细胞的作用，考虑可能与以下几方面的因素有关：患者机体免疫功能低下，未能产生足够数量的具有杀伤活性的t细胞来对抗体内大量恶性增殖的肿瘤细胞，这从本实验室以往的研究发现l患者胸腺近期输出功能低下的结果可以得到证明1；克隆性增殖的t细胞功能不成熟，不能分泌杀伤靶细胞所需要的物质如：穿孔素和颗粒酶等；患者体内存在抑制这些克隆性t细胞杀伤活性的因子，使其不能有效发挥作用；白血病患者内环境紊乱，而体内杀伤过程是依赖温度、能量以及g2+离子存在的过程；肿瘤细胞增殖的速度超过了t细胞的杀伤速度等等。总之，tl对靶细胞的杀伤是个复杂的过程，目前对这一过程以及克隆性增殖的t