快速筛选调节肝脂酶活性中药成分方法的研究

1、快速挑选调节肝脂酶活性中药成分方法的研究【摘要】目的研究快速挑选调节肝脂酶活性中药成分的方法。方法利用大鼠肝组织匀浆和比色法检测肝脂酶(HL)活性，观察不同实验条件及中药成分对HL活性的影响。结果正常大鼠肝组织匀浆具有明显的HL酶促动力学特性，其HL脂解活性有明显a2+依赖性，受钙调蛋白拮抗剂盐酸异丙嗪抑制，符合纯化HL的酶促动力学特性;挑选得到齐墩果酸和人参皂苷Rb22个增强肝脂酶活性成分。结论首次用大鼠肝组织匀浆和脂酶比色测定法建立了一种简便易行、快捷的调节肝脂酶活性中药有效成分挑选方法，可用于影响肝脂酶活性的中药调脂活性成分的挑选，并从有效方药组分中挑选得到有增强HL活性的组分。【关键词

2、】肝脂酶;快速挑选;大鼠肝匀浆;复方贞术调脂方;肝脂酶激活剂Keyrds:hepatilipase(HL);rapidsreening;ratliverhgenate;FufangZhenzhuTiazhiFang(FTZ)reipe;hepatilipasativatr肝脂酶(hepatilipase,HL)是重要的脂代谢酶，其合成、分布、活性的变化和高脂血症、脂肪肝、动脉粥样硬化等亲密相关。肝组织和血浆中HL酶活性的降低，可引起高脂血症1-3，并在脂肪肝发病中起重要作用4，5。为了研究中药降血脂的物质根底和挑选新药，本研究以HL为靶点，以FTZ组分为调节HL活性成分的挑选对象，研究建立一种

3、采用大鼠肝匀浆比色法测定肝脂酶活性，快速挑选调节HL活性中药有效成分的方法，现报道如下。1材料与仪器1.1材料与试剂三七总皂苷、人参皂苷Rb2、齐墩果酸、盐酸小檗碱、丹参素由中国药品生物制品检定所提供;总脂酶试剂盒(南京建成生物工程研究所);大鼠肝脂酶的ELISA测定试剂盒(武汉中美科技);磷酸盐等试剂均为国产分析纯试剂;盐酸氯丙嗪(Siga公司);十二烷基硫酸钠(SDS)、二硫代苏糖醇(DTT)(Ares)。1.2实验动物SpagueDaley(SD)大鼠,由广东省实验动物中心提供，雄性，体质量200250g，符合SPF级标准，合格证号：检证字2022A056。1.3主要仪器2方法2.1大鼠

4、肝脏匀浆制备及HL含量测定2.2肝组织匀浆中HL活力的比色测定方法HL活性测定是以脂肪乳剂为底物,在37、pH9.5条件下与一定量的肝匀浆37水浴保温30in，肝匀浆中的HL可将底物中的TG水解为甘油和游离脂肪酸(freefattyaid,FFA),用有机溶剂二次提取FFA，铜试剂比色法测定生成的FFA含量,计算反响体系肝匀浆中肝脂酶的比活性1U=1l/LFFA/(hg)，即每毫克匀浆蛋白每小时在反响系统中催化生成1l/L的FFA定义为1个酶活性单位8，9。2.3大鼠肝匀浆HL酶活性测定条件的优化2.3.3温度和DTT对酶活性影响搜集肝组织匀浆后立即测定肝脂酶活性,然后分别测定25、4、-20

5、、-70下保存24h的肝脂酶活性，并测定加终浓度为1l/L的DTT肝组织匀浆在4、-20，-70保存24h、30d时的HL活性。2.4抑制剂对肝匀浆中HL活性的影响2.5FTZ不同调脂组分对大鼠肝HL的影响2.6统计学分析以SPSS16.0软件进展统计学处理,所有结果用以均数标准差(s)表示,各均数间用t检验，P0.05为差异有显著性。转贴于论文联盟.ll.3结果3.1HL活性测定的酶量曲线以肝组织匀浆上清作为标本,测定不同匀浆蛋白量时HL酶活性，结果如图1。由图1可见,匀浆量在050L之间，HL酶活性随着匀浆蛋白量的增加而递增，匀浆蛋白量与酶活性之间呈一直线关系(r=0.9988)。3.2p

6、H值对肝匀浆中肝脂酶活性的影响3.3肝脂肪酶活性与反响时间曲线在090in内，酶活性随温育时间延长而增加，温育90inHL活性达最大值4.98U，温育30inHL活性达最大值的91.5%(4.61U)，但超过90in，HL活性反而显下降趋势(见图2)。为方便试验，选择30in作为其他实验温育时间。3.4温度对大鼠匀浆HL活性的影响肝匀浆中HL活性在25，保存24h，酶活性下降80%，4保存24h酶活性下降35%，在-20保存24h，酶活性下降5%，在-70，保存24h，酶活性下降3%。说明肝匀浆中HL活性在室温下不稳定，在4也不够稳定。在-20和-70下保存HL酶活性较稳定。大鼠肝匀浆制备后，

7、立即参加DTT至终浓度为1l/L的肝匀浆中HL酶活性在25，保存24h，HL酶活性只下降40%，说明DTT对肝匀浆中HL酶活性有保护作用。参加DTT至1l/L的肝匀浆在-70下保存1个月，仍有很高HL酶活性，相当于刚制备的肝匀浆HL酶活性的95%(见表2)。说明肝匀浆参加DTT在-70低温冷冻条件下可较长时间保存而维持其HL酶活性相对稳定。表2不同保存条件下大鼠肝匀浆HL活性变化3.5钙浓度对大鼠匀浆肝HL酶活性的影响在钙浓度为0.001、0.005、0.025、0.10l/L的反响体系中,大鼠肝匀浆中HL酶活性分别比无钙反响体系增加39倍,钙浓度为0.005l/L时HL酶活性增加最大达9倍(

8、见表3)，说明体系中游离钙浓度(a2+)对大鼠肝匀浆中HL活性有激活作用。表3钙浓度对大鼠肝HL活性的影响3.6抑制剂对大鼠肝HL的影响3.7FTZ不同组分对大鼠肝匀浆HL活性的影响0.12.5g/L的FTZ提取物及其活性成分齐墩果酸、三七总皂苷、人参皂苷Rb2能浓度依赖性增强HL活性，增加幅度可达75%，而高浓度盐酸小檗碱那么可抑制HL活性，抑制率可达40%;丹参素对HL活性影响不明显(见图3)。4讨论人类HL和脂蛋白脂肪酶(LPL)同属于脂酶家族，然而却是两种不同性质的酶。HL活性不需要Ap和肝素激活作为激活剂，不受高盐浓度及鱼精蛋白的抑制，并且其底物特异性不高;而LPL活性目前只能在肝素

9、化后进展。因此，可以在高浓度钠盐而无肝素的反响系统中直接用比色法测定肝脂酶活性10。细胞分子靶标是新药研发的常见快速挑选模型。用HL建立影响HL活性的药物挑选模型有望快速挑选到中药活性成分。但由于制备纯化HL的方法复杂，本钱高，一般实验室难以用纯化HL进展大规模挑选实验。比色法是检测大鼠肝匀浆HL活性程度的经典方法8-10，为便于在HL分子靶标程度挑选调节HL活性的药物，本研究用大鼠肝匀浆和比色法测定HL活性，建立检测HL活性的快速挑选模型。研究说明大鼠肝组织匀浆制备的HL酶活性很高，而且较稳定,在-70下保存其活性可维持稳定1个月以上。在pH9.5的磷酸钾缓冲液中具有明显的酶促动力学特性，其HL脂解活性有明显a2+依赖性，受钙拮抗剂盐酸异丙嗪的抑制并受外表活性剂SDS的抑制，符合文献纯化HL的酶促动力学特性1,11。本研究结果显示,大鼠肝组织匀浆中HL酶丰富，制备方法简单易行，本钱很低,配合成熟的脂酶活性比色法检测，可用于快速挑选影响HL酶活性的中药调脂活性成分，并从有效方药组分中挑选得到有增强和抑制HL活性的组分。首次实验证明,使用大鼠肝组织匀浆和脂酶比色测定HL活性是快速挑选影响HL活性中药活