脂康调节高脂血症家兔肝脏LDLR mRNA水平的实验研究

1、脂康调节高脂血症家兔肝脏LDL-R mRNA程度的实验研究【摘要】目的通过建立新西兰家兔高脂血症模型,讨论肝脏低密度脂蛋白受体基因程度与高脂血症形成的关系。方法1建立高脂血症家兔模型；2应用原位杂交方法检测肝脏低密度脂蛋白受体基因程度。结果1成功建立高脂血症家兔模型；2脂康方剂可有效降低血脂程度，并能有效上调肝脏低密度脂蛋白受体基因程度。结论脂康方剂可激活肝脏细胞膜LDL-R基因表达，使LDL-R的活性增强，从而加速脂蛋白的分解，有效调节血脂程度。【关键词】高脂血症；低密度脂蛋白受体；基因表达StudytheeffetfZhikangnbld-lipidandldensitylipprtEin

2、reeptrRNAinrabbit【Abstrat】bjetiveTstudytheiuneehanisfZhikangtntrlthedevelpentfhyperlipideia.ethds(1)TsetuphyperlipideiadelsfNeZealandrabbits.(2)Tbservethepathlgialhangesinliver.(3)TstudytheeffetsfZhikangbydetetingthelevelsthegenefldensitylipprteinreeptrthrughISHH(insituhybridizatinhistheistry).Resul

3、ts(1)Ahyperlipideiadelassuessfullyestablishedbyusinghigh-fatdietinNeZealandrabbits.(2)Zhikanganeffetivelyreduethelevelflipidsanditaninreasethelevelsfthegenefldensitylipprteinreeptr.nlusinZhikanganeffetivelyreduethelevelflipidsandiprvethenditinfatherslersis,atthesaetie,itaneffetivelyregulatetheiunefu

4、ntinsnthelevelsfgenefldensitylipprteinreeptr.【Keyrds】hyperlipideia;ldensitylipprteinreeptr;geneexpressin高血脂能导致冠状血管等全身血管的不同程度硬化，导致各种临床并发症。目前治疗血脂异常、动脉硬化的西药虽然在临床获得了一定的疗效，但同时其对肝、肾功能会产生一定的影响，不利于长期服用。研制毒副作用小，疗效显著、具有多靶点综合治疗效应的中药复方制剂，是目前中医临床研究的一个热点。中药脂康由黄芪、沙棘、山楂、红花、丹参、三七粉等组成，具有健脾益气、祛痰降浊、调整阴阳气血和脏腑功能、活血化瘀之成效，

5、适用于高脂血症及轻中型冠心病，在临床上应用数年，对高脂血症及动脉硬化的防治上已获得了很好的疗效。脂康通过去除人体内的痰浊、瘀血等有害物质，抑制脂质合成，促进脂质的转运和去除，加速脂质排泄等多种途径调节血脂。本实验主要从基因程度上研究脂康对高脂血症家兔肝脏低密度脂蛋白受体基因表达的调节作用，从而讨论脂康调节血脂的主要机理。1材料与方法1.1脂康方药的制备本处方由沙棘、山楂、丹参、红花、黄芪、三七等为主组成。经醇提、水提、枯燥后制成丸剂，每丸0.5g。等临床剂量按人和动物体外表积换算，相当于60kg体重人每日的药量。1.2实验动物造模及用药方法纯种新西兰大耳白兔60只，体重1.92.1kg,兔龄4

6、个月，随机选取10只为正常组，喂饲普通颗粒饲料，150gd，其余50只给予高脂饲料1胆固醇、5蛋黄粉、5猪油、89普通饲料喂饲，150gd。于第4周末根据胆固醇情况随机分为5组，每组10只：模型对照组给予高脂饲料喂饲，150g/d；其余用药组除给予高脂饲料喂饲150g/d外，脂康低剂量组给予脂康浸膏0.2g/kgd；脂康高剂量组给予脂康浸膏0.4g/kgd；血脂康对照组给予血脂康0.1g/kgd；辛伐他汀对照组给予辛伐他汀0.8g/kgd。喂饲8周后，麻醉，心脏取血，用于血脂工程检测。取靠近肝门静脉处的肝脏组织，直径约2，用浓度10福尔马林固定，石蜡包埋，切片，HE染色，用光镜观察。另取肝脏组

7、织，直径约1，用浓度4%的多聚甲醛固定后做LDL-RRNA原位杂交检测。1.3生化指标检测分别于用药前取耳缘静脉血及用药后心脏取血10l，离心3000r/in，10in，取血清分装，20冰箱保存，血清总胆固醇(T)和甘油三酯(TG)及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-)含量测定采用酶法，根据Friedard公式法计算低密度脂蛋白胆固醇(LDL-)，即LDL-=T-TG/2.2+HDL-)。动脉硬化指数AIP为TG与HDL-摩尔浓度比值的对数。血脂检测试剂盒北京中生生物工程高技术公司消费。1.4肝脏组织LDL-RRNA原位杂交检测LDLRISH原位杂交试剂盒:武汉博士德生物工程提供。1.41实验步骤(

8、1)将新颖的肝组织切成不超过4的小块，并及时用固定液固定1h。(2)常规脱水、浸蜡、包埋，切片厚度为68。(3)石蜡切片经常规二甲苯、乙醇脱蜡，滴加H202，室温510in以灭活内源性酶。(4)暴露RNA核酸片段:切片上加3%柠檬酸新颖稀释的胃蛋白酶。371215in，清洗。(5)后固定:胃蛋白酶消化后在玻片上滴加固定液室温固定10in，清洗3次。(6)预杂交:首先将湿盒准备好，每张切片滴加20l预杂交液，放入湿盒内，38424h，甩去多余的液体。(7)杂交:在每张玻片上滴加20l杂交液，将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。放恒温箱杂交过夜。(8)杂交后洗涤。(9)滴加封闭液:放入

9、3730in后取出，甩去多余液体，不洗。(10)滴加生物素化鼠抗地高辛:放入3760in，PBS洗涤。(11)滴加SAB:放入3730in，PBS洗涤。(12)滴加生物素化过氧化物酶:37恒温箱中放置30in，PBS洗涤。(13)DAB显色:使用DAB显色试剂盒，滴至玻片上，显色3050in，充分水洗，苏木素复染，充分水洗，酒精脱水，二甲苯透明，封片。1.42原位杂交实验结果断定光学显微镜下观察结果的断定标准:原位杂交结果以细胞浆内或核膜上出现棕黄色颗粒者或斑片为阳性细胞。1.43分析方法和统计学处理计算机图像分析，在图像卡IB586和lypusBX60显微镜组成的图像处理系统上，测定阳性细胞

10、数:每组每只大鼠各5个高倍视野(1040)下原位杂交阳性细胞率(%)。1.5结果统计计量资料采用单因素方差分析，F检验，结果用均数和标准差(xs)表示。用SPSS10.0统计软件对结果进展统计。2实验结果2.1血脂程度变化本实验结果提示脂康高剂量组对高脂血症家兔血清T、TG、LDL-程度有显著的降低作用P0.01，对HDL-有显著升高作用P0.01。脂康高剂量与西药辛伐他汀比较，在降低家兔血清T、TG、LDL-的作用相近，升高HDL-作用优于辛伐他汀；与中药血脂康比较，在降低家兔血清T、LDL-的作用明显优于血脂康，降低TG程度作用相近，升高HDL-程度作用优于血脂康。2.2肝脏LDL-RRN

11、A程度变化肝脏LDL-RRNA的阳性表达信号可见细胞浆内出现棕黄色颗粒，应用图像分析系统计算各组的阳性表达率，结果见表1。正常对照组与模型对照组、脂康高剂量组及辛伐他汀对照组比较差异有显著性(P0.01),模型对照组明显低于其他各组，比较差异有显著性(P0.01),脂康高剂量组明显高于其余各组。表1肝脏LDL-RRNA程度变化(略)3讨论本研究利用核酸原位杂交法观察脂康对高脂血症兔肝细胞LDL-R基因表达的影响。研究结果说明，模型组高胆固醇兔肝细胞LDL-RRNA表达程度与正常组相比明显降低，而当高胆固醇兔给予脂康和相关药物后，其肝细胞的LDL-RRNA表达程度又明显进步，尤其是高剂量脂康组最

12、为明显。可见，脂康有显著激发、上调高血脂兔肝脏细胞LDL-R基因表达的效应，从分子程度上能有效地调节脂质代谢作用。近年来，国内外学者对LDL受体的功能从生化、免疫、遗传等方面做了大量研究，认为血浆中2/3以上的LDL是通过肝脏LDL受体途径降解的，其基因表达异常可影响LDL的去除，使血中LDL程度升高，导致高脂血症、动脉粥样硬化1。正常情况下，细胞LDL受体的数量决定血循环中LDL被去除的速度。细胞内含胆固醇含量的多少反响地控制着LDL受体的合成2。当细胞处于高胆固醇负荷时，可下行抑制LDL-R基因的转录，使其表达下降，LDL-R数目减少3。反之亦然。细胞浆中的游离胆固醇及其氧化产物如7-羟胆固醇、25-羟胆固醇通过调控LDL受体基因的转录，调节细胞内LDL-R合成，进而影响细胞摄取LDL，当细胞内游离胆固醇及其氧化产物含量增高时，LDL-R基因转录程度下降，抑制细胞LDL-R蛋白质的合成，细胞膜LDL-R的数量下降，减少细胞对LDL的进一步摄龋反之，那么LDL-R基因反响性转录增强，细胞合成LDL受体增加，促进细胞摄取LDL，促进胆固醇的摄入4。脂康进步LDL-R基因表达的可能机理是：AS的病理根底主要是肝脾失调，而痰瘀是其病变之标，脂康通过理脾，增强了脾的主动运化功能，而脾的正常运化、升清降浊又促进了肝的正常疏泄。因此在治疗时以调脾为主同时注意调肝、疏肝，从整体上改善了