发酵综合实验实验报告

1、目录摘要 错 误!未定义书签引言 4材料与方法 错 误!未定义书签结果与讨论.错 误!未定义书签 错 误!未定义书 4 总结 签 .错 误!未定义书签 .错 误!未定义 5 心得体会 .书签参考文献 . 蛋白酶的发酵工艺研究摘要 中性蛋白酶是最早被发现并广泛应用于工业化生产的蛋白酶 制剂，可用于皮革脱毛、软化、畜禽血液蛋白质水解、果酒、 啤酒和 饮料的澄清以及医学治疗等应用领域中。 本文对一株产中性蛋白 酶枯 草芽孢杆菌（） 的发酵条件进行了研究，考察不同因素条件下对产 酶 的影响。通过摇瓶培养研究碳源浓度， 不同接种量对蛋白酶产量的影 响。利用酪蛋白培养基的平板实验观察蛋白酶的性质。 利用发

2、酵罐培 养 观察时间对产酶的影响结果表明：豆饼粉100ml，玉米粉100ml,麸 皮粉100ml，磷酸氢二钠100ml，磷酸二氢钾100ml, pH为最适宜培 养基组分。并且发酵罐培养的产酶活性高于摇瓶培养。 关键词：中性蛋 白酶； 枯草芽孢杆菌； 摇瓶培养； 发酵罐The Fermentation Process Research of ProteaseAbstract Neutral protease is the first to be discovered and widely used in industrial production of the protease preparat

3、ion ,which can be used for leather hair removal, softening, animal blood protein hydrolysis, wine, beer and beverage clarification, and in applications such as medical fermentation conditions of a Bacillus Subtilis（） which can produce neutral protease were studied in this paper. Under the condition

4、of different factors to examine the influence of enzyme study discussed concentration of carbon source, different inoculum on protease yield by shake flask. Casein petri dishes has been used in the observation of the nature of the protease. Fermentation tanks culture was used for observing times eff

5、ection on the production of enzymes. the results showed that soybean meal 100ml, corn flour 100ml,wheat bran powder 100ml,disodium hydrogen phosphate 100ml,potassium dihydrogen phosphate 100ml, pH was the most appropriate medium composition. Enzyme production activity of Fermentation tanks culture w

6、as higher than shaking culture.Keywords: Neutral protease ； Bacillus subtilis ； Shaking culture ； Fermentation引言 自然界中有大量产泌外蛋白酶微生物，其中以微生物的产酶活性 最 优。微生物来源蛋白酶一般按蛋白酶的最适 pH 值分为酸性、中性、 碱性蛋白酶三类。中性蛋白酶最早被发现并广泛应用于工业化生产 中。 本实验采用枯草芽孢杆菌做为研究菌株，其产酶量大，酶的耐热 性好， 因而被广泛应用于工业化生产中。此菌株在 C/N 为 1:4左右时 的产蛋 白酶活性最高，并且有机 N 源优于无机

7、N 源，因而其发酵成 本较高。 探索新的发酵途径， 寻找更加经济的组合方式显出了重大的 意义。此次实验主要做蛋白酶摇瓶发酵工艺的优化，改变发酵的 C 源浓度 和 接种量，测定蛋白酶酶活，以确定最优的发酵工艺条件。提取发酵 液中 的蛋白酶，测定酶活算出前后总活力，计算得率。并且进行发酵 罐培养 实验， 比较发酵罐培养与摇瓶培养的产酶活性差异。 通过此次 实验学 习蛋白酶的测定方法和发酵液酶蛋白的初步提取方法， 考察不 同发酵 条件对微生物产酶的影响，以及熟悉小型发酵罐的使用方法， 包括灭 菌，清洗，加料，接种，取样等环节。材料与方法菌种枯草芽孢杆菌（）试剂（1）生理盐水：称取 NaCl ,用蒸馏

8、水定容至 100ml, 即为 %生 理 盐水，121 C灭菌20min。（2）福林试剂（ Folin 试剂）:使用时加 2 倍蒸馏水稀释，即成已 稀释的福林试剂。（ 3）碳酸钠溶液：称取无水碳酸钠 , 用蒸馏水定容至 1000ml。（4）三氯乙酸（TCA）溶液：称取三氯乙酸，用蒸馏水定容至 1000ml。（5）磷酸盐缓冲液：称取磷酸二氢钠（NaH2PO4吆H2O），用蒸馏 水定容至1000ml，即成溶液（A液）。称取磷酸氢二钠（Na2HPO42H2O），定容至1000ml,即成溶液（B液）。取A液28ml和B液72ml,再用蒸馏水稀释1倍，即成L pH的磷 酸盐 缓冲液。（6）2%酪蛋白溶液：

9、准确称取干酪素2g,称准至，加入氢氧化钠 10ml ，在水浴中加热使溶解 （必要时用小火加热煮沸） ，然后用 pH 磷 酸盐缓冲液定容至 100ml 即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保 存， 否则极易繁殖细菌，引起变质。（7）100“ g/ml酪氨酸溶液：精确称取在105C烘箱中烘至恒重 的 酪氨酸，逐步加入6ml1N盐酸使溶解，用盐酸定容至100ml，其 浓度 为1000Ug/m, I再吸取此液10ml, 以盐酸定容至100ml，即配成100卩 g/ml 的酪氨酸溶液。此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内 保存，以免 繁殖细菌而变质。培养基牛肉膏蛋白胨培养基(g/100ml)：牛肉膏，蛋白

10、胨1，氯 化钠，pH ,121 C灭菌 20min。( 2)酪蛋白培养基 A( g/100ml) :牛肉膏，蛋白胨，氯化钠，奶 粉 5，琼脂 2，灭菌 20min 。( 3)种子培养基 1 ：牛肉膏蛋白胨培养基。( 4)基本发酵培养基 1 ( g/100ml) :豆饼粉，玉米粉，麸皮粉， 磷酸氢二钠，磷酸二氢钾， pH 灭菌 20min。蛋白酶活力的测定(福林 -酚法， ZBX66030-87) :原理：福林 -酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色 (钼 蓝和钨蓝混合物) ，由于蛋白质分子中含有酚基的氨基酸(如酪 氨酸， 色氨酸等)，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。因此可利 用此原理测

11、 定蛋白酶活力。通常以酪蛋白为底物，在一定 pH 值和温 度条件下，同酶 液反应，经一段时间后终止酶促反应，经离心或过滤 除去酪蛋白等沉淀物 后取上清液，用 Na2CO3 碱化，再加入福林 -酚试 剂显色， 蓝色的深浅 与滤液中生成产物酪氨酸量成正比； 酪氨酸含量 用分光光度计在 660nm 波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。酪氨酸标准曲线的绘制：取 6 支干燥试管编号，分别吸取不同 浓度 酪氨酸1ml,各加入碳酸钠5ml,再加入已稀释的福林试剂1ml。摇匀置于水浴锅中。40C保温发色20min,再用721型分光光度计进行测 定（波 长 660nm ）。表一 标准曲线绘制加样编号123456

12、酪氨酸0/mlH2O/ml0Na2CO3/ 555555ml福林-酚111111/ml蛋白酶活力测定：试管中加入 M pH 的磷酸盐缓冲溶液稀释后 的酶液1 ml, 40U预热5 min，加入预热过的pH的酪蛋白1ml,摇匀，在40水浴中准确反应10 min。用2 ml TCA终止酶反应，静 置10 min 。过滤后取 1ml 滤液,加入 mol 碳酸钠 5ml ,再加入已稀 释的福林试剂1ml。空白试验测定方法同上，唯有加酪蛋白之前先加mol三 氯乙酸2ml使酶失活，再加入酪蛋白。蛋白酶酶活力单位的定义：在40下每分钟水解酪蛋白产生1嵐酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位蛋白酶活力(“/m) l

13、 =A*4*N/10式中：A由样品测得OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数；N 酶液稀释的倍数；10反应 10min.实验步骤摇瓶培养( 1 )种子培养：在无菌条件下自斜面菌种挑取一环菌体，接入 装有 30ml种子培养基的250ml三角瓶中，在301C振荡培养12-16h。涂平板：取种子培养液1ml,用无菌生理盐水稀释，取10- 5，10-6 稀释度，涂布在酪蛋白培养基平板上。每个稀释度涂 2 套平板，每套平板加稀释菌液，用无菌玻璃凃棒均匀地涂满整个平板表面。发酵培养：按 1%的接种量，将种子液接种到发酵培养基 中， 振荡培养 72h。蛋白酶摇瓶发酵工艺优化：改变发酵的某一条件，如碳 源种

14、类，氮源种类，C/N，pH，装液量，接种量等，测定蛋白酶酶活，以确 定较优的发酵工艺条件。提取：将培养物合并，抽滤除菌体，取 30ml 滤液测定的 蛋 白酶酶活，算出总酶活 。向滤液加入硫酸铵使浓度达饱和，静置 过夜， 过滤得湿固体(初步提取物)，称重后溶解于 30ml 磷酸缓冲液， 测定酶 活，算出总酶活。发酵罐发酵（1）种子培养：在无菌条件下自斜面菌种挑取一环菌体，接入 装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，在301C振荡培养16-18h。（2）接种：将浸有酒精的脱脂棉围绕在接种口周围，点火打开 接 种口，将种子培养液注入。接种量为 1%-5%，盖好接种口，调节搅 拌转 速至所需数值

15、，培养开始。（3）取样：为了解培养过程中的变化，需定时取样进行样品分 析。由于罐内为正压，打开取样管时，样品自然流出。取样时应将上 一次 残留在取样管中的培养液去除后再取样。 另外，取样后应通过加 热蒸 汽，以防取样管路污染杂菌。（4）培养结束：将电极与培养液全部取出，发酵罐冲洗干净。结果与讨论酪氨酸标准曲线在A=660nm时，酪氨酸浓度在20100ug/ml范围内，线性关系良好。标准曲线见图 1图 1 酪氨酸标准曲线发酵工艺研究碳源浓度对发酵的影响采用 50ml 基本发酵培养基的摇瓶培养， 通过改变豆粉含量来改变碳源 浓度，以研究浓度对发酵产蛋白酶的影响。测定发酵液蛋白酶活力， 以酶 活力高

16、低作为指标，以初始发酵培养基的酶活力作为对照。注： 1 豆饼粉浓度为 100ml；2 豆饼粉浓度为 100ml；3 豆饼粉浓度为 100ml。 从图 2 可以看出，豆饼粉浓度为 100ml 时，枯草芽孢杆菌的产酶活性最 高。豆饼粉浓度为 100ml 时，由于碳源量不足，限制了菌体生长，因 而 导致产酶量较低。豆饼粉浓度为 100ml 时，碳源量充足，导致 C/N 升高 而限制了产蛋白酶的活性，故而，最适豆饼粉浓度为 100ml 为产 蛋白酶的最适宜浓度。接种量对发酵的影响将种子液以 1%，2%，3%分别接种到 50ml 基本发酵培养基上，摇瓶培 养，测定酶活。25002000图 3 接种量对发

17、酵的影响注：1 接种量 1%；2 接种量 2%；3 接种量 3%。 由图 3 可以看出，接种量对 发酵的影响不大，图中显示由 量，菌株的产蛋白酶活力逐 1%3%接种 渐增加，未达最大值。发酵罐培养按所述方法进行发酵培养注：1 24 小时； 2 42 小时； 3 48 小时。由图 4 可以看出，前 24h 发酵产酶活性很低，这主要是由于接种后 24h 发酵罐中主要发生菌体生长的反应， 蛋白酶是生长偶联型产物， 此时 产量很低。到 48h 达到高点，蛋白酶积累量很高。蛋白酶的提取按（ 5）所述方法进行酶的提取，结果如下：表二 酶蛋白提取得率酶活总酶活得率30ml母液2230u/ml66900u%湿

18、固体131559u/g44730u平板实验观察蛋白酶性质取种子培养液不同稀释度 10-1 10-6 分别接种于平板上， 30oC 培养 48h观察平板上的透明圈图 5 10-5 稀释度下的透明 圈图 5、6 平板所用培养基为酪蛋白培养基， 枯草芽孢杆菌由于能产生泌 外蛋白分解酪蛋白而出现透明圈。4 总结 本实验对一株产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌进行性质研究，对 C 源浓 度及接种量进行单因素实验。结果表明，最适宜豆饼粉浓度为 100ml, 最适接种量为 3%。通过比较发酵罐培养实验与摇瓶培养实验发 现， 发酵罐培养产中性蛋白酶的能力强于摇瓶培养。 这是由于， 发酵 罐培 养的传质与溶氧条件优于摇瓶培养。5 心得体会此次实验由于时间和条件的限制， 并不能对影响发酵产酶的所有因素 进 行单因素试验， 因而局限了实验结果的利用价值。 通过此次实验我 系 统的认识到， 做发酵条件优化实验的具体方法和步骤， 以及注意事项。并且初步掌握