口腔脱落粘膜细胞中基因组DNA的提取

1、实验九 口腔脱落粘膜细胞中基因组DNA的提取原理利用煮沸法裂解口腔脫落粘膜使得细胞破碎，DNA片段释放，基因组DNA溶解于上 清中，可取做PCR反应模板。器材1、1.5ml 离心管2、微量移液器3、高速冷冻离心机4、加热锅试剂1 、PBS( 137mmol/L NaCI, 2.7mmol/L KCI, 4.3mmol/L Na2HPO4.7H2O, 1.4mmol/L KH2PO4)2、TE溶液实验步骤：1、用棉签刮拭口腔粘膜3-4次，将其放入1.5ml离心管内，加入1 ml PBS缓冲液或双 蒸水，反复挤压搅动，使细胞脱落；2、10000 r/min 离心 3min；3、倒掉上清液，沉淀加入

2、100ul TE缓冲液；4、高速振荡5-10sec，悬浮沉淀，沸水煮10min后冰浴3-5 min；5、高速振荡 5-10sec； 10000/min 离心 3min；6、取上清液用于扩增反应；4C保存或冻存剩余DNA。实验十二 瘦素受体基因的限制性片段长度多态性分析原理限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，缩写RFLP）技术的原 理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶 切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入 和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等

3、均可导致RFLP的产生。瘦素受体（LEPR）基因，又被称为糖尿病基因，于1995年被定位克隆，属细胞因子受 体超家族，由1165个氨基酸组成。LEPR是肥胖基因编码产物的受体，其基因变异主要影 响机体的体脂分布和脂肪代谢，并通过调节胰岛素的敏感性来参与糖尿病的发生。LEPR基 因多态性来自于其基因序列中的单碱基变异。目前研究已经证实了瘦素受体基因多种突变和 多个多态性位点。人类LEPR基因第六外显子上存在有Gln223Arg变异（第668位碱基A -G变异，使223位氨基酸Gln被A rg取代）。限制性内切酶MspIMspI酶的酶切位点：5CCGG35 CCAG33 GGCC53GGTC5PC

4、R扩增产物为440bp，内切酶MspI作用后有三种结果：AA纯合子440bp, GA杂合 子 140bp、300bp、440bp，GG 纯合子 140bp 和 300bp，见图 1。图1瘦素受体基因Gln223Arg多态性电泳结果 注：7 : DNA分子量标准1,6 : AA 型（440bp）2,3 : AG 型（140bp, 300bp 和 440bp）4,5 : GG 型（300bp 和 140bp）器材1、DNA 扩增仪2、高速台式离心机3、标本裂解仪（或沸水浴）4、电泳仪5、平板电泳槽6、旋涡混匀器7、紫外分析仪8、微量进样器9、恒温水浴箱试剂1、引物： 上游 5 -ACCCTTTAA

5、GCTGGGTGTCCCAAATGA3下游 5 -GCTAGCAAATATTTTTGTAAGCAATT3z2、PCR Kit3、限制性内切酶Msp IKit4、电极缓冲液5、琼脂糖凝胶（或聚丙烯酰胺凝胶）6、溴乙锭（1mg/100ml）实验步骤一、PCR1、 PCR 反应在 20ul 反应体系中进行，冰上操作，依次加入10 x缓冲液2.0ul2.5uM dNTP1ul5umol/L 上下游引物各 1.0ulTaqDNA聚合酶1U模板 DNA（ 1ng-1ug）2.0 ul加 ddH2O 至20ul2、扩增条件：94C变性3min,然后与94C变性40s, 58C退火35s, 72C延伸40s, 循环35次后，72C保持5min，扩增产物4C保存。二、酶切鉴定1、酶切反应液的准备:在 Eppendorf 管中依次加入双蒸水3 yl10 x酶切缓冲液1 ylPCR产物5 ylMsp I 酶液（lOu/yl）l yl2、将装有上述反应液的Eppendorf管于37C水浴保温1.5小时，直接电泳鉴定。 三、电泳鉴定在酶切扩增产物中加入2卩1 6X载样缓冲液