蜘蛛多肽毒素

1、W海卷M彳身优毕业设计(论文)开题报告题 目：敬钊毒素-XI (JZTX-XI )及其突变体M5A-JZTX-XI的固相合成与氧化复性院 系：化学化工学院专 业：生物工程学生姓名： 贺娟 学 号： 200606030114指导教师：曾雄智 蒋开军2010年4月8日毕业设计（论文）开题报告1.文献综述：结合毕业设计（论文）课题情况，根据所查阅的文献资料, 每人撰写-500字以上的文献综述，文后应列出所查阅的文献资料。敬钊毒素-XI突变体M5A-JZTX-XI的化学合成与氧化复性的文献综述一、蜘蛛多肽毒素的研究进展自然界中很多动物会利用自身产生的多肽毒素来捕食猎物和防御天敌，如蜘蛛、蛇、芋螺、河豚

2、、蜜蜂、蜗等。蜘蛛就是利用自己的螯爪把毒液注射到猎物的体内，从而达 到麻痹或致死猎物的作用。而在动物毒液中，最为丰富也是研究最多的一类物质就是分 子量在100cgJ10000 Da的多肽类毒素。在这些毒素中，神经毒素又是多肽毒素中含量最 多的成分，其主要生物学功能是作用于靶细胞膜上的各种离子通道，如钾、钙、钠、酸 敏感通道等1-5。有些多肽毒素呈现出作用单一性的特点，可以成为一种诊断试剂用于药 理学研究。一些作用较强的毒素可以用来治疗疾病，如 2004年被美国食品与药品管理局 批准的治疗慢性神经疼痛和癌症病人疼痛的神经毒素 Conotoxin-MVIIA ,就是从海洋动物 芋螺中发现的6。以神

3、经毒素为先导分子研制出的某些药物，也取得了巨大的成功。如 美国默克公司以非洲曼巴蛇神经毒素分子为模板制成的多肽新药，可以有效地治疗心肌 绞痛，多肽毒素研究已成为世界新药研究的一个热点 70我国的学者也从虎纹蜘蛛毒素 中发现了一种多肽毒素HWTX-XJ对于治疗急性胰腺炎有良好的治疗前景网。二、蜘蛛毒素的组成人们一般把蜘蛛毒素分子分为三大类：第一类是分子量 1 kDa以下的小分子物质。 第二类也是含量最丰富的一类，为分子量1到10 kDa之间的多肽类毒素。第三类是分子 量10 kDa以上的蛋白质类。毒蜘蛛是一个天然的蛋白质生产库，蜘蛛所分泌的毒素中通 常是含多种毒素，我们可以通过分离、纯化获得我们

4、所需的毒素，然后测定其一级结构， 进行天然肽类毒素的人工全化学合成、建立蜘蛛毒素的蛋白质组图谱、蜘蛛毒素的蛋白 质工程改造以及对其中多种在药物学和神经生物学研究上有重要学术价值和应用前景 的毒素进行开发利用。目前研究较多的是虎纹捕鸟蛛、海南捕鸟蛛和广西大疣蛛的毒素。 这些毒素主要是作用于动物细胞的离子通道，用以麻痹或杀死目标。三、 毒素中的小分子物质以前的研究探明，蜘蛛毒素中的小分子物质主要有无机盐类 （Na+、K+、Ca2+、Cl-）、 氨基酸、核甘酸、有机碱、多胺类物质和神经递质（如多巴、GABA、肾上腺素）等90目前，很多小分子物质的作用和意义还不清楚，有人认为小分子物质可能会加强毒素对

5、 猎物的伤害，还有人认为只是一些降解产物。在对小分子物质的研究中，对多胺类物质的研究已经呈现一个新的领域。Gerard P.Ahern等人认为一些多胺类是潜在的辣椒素受体。日本发现的多胺类小分子JSTX-3能阻断突触后膜的谷氨酸受体。通过对越来越多的多胺类物质结构的解析，发现多胺类的毒 素都有一些共同的特点，分子头部通常是一个苯酚基团或是一个呷咪基团，分子尾部通 常是一个胺基或是一个胴基，中间是多胺构成的主链。通过对多胺类的了解深入，人们 开始意识到它们可以成为选择性作用于离子通道的工具试剂，在医药和科研上发挥更大 的作用。四、蜘蛛毒素的蛋白质类成分蜘蛛蛋白质类成分富含多种活性酶，血蓝蛋白，未

6、知蛋白，以及少量的毒素蛋白。酶类主要包括：（1）能量代谢相关酶类，如ATP合成酶、NADH脱氢酶、ATP-NAD 激酶、乙酰辅酶AS化酶、谷胱甘月*转移酶等；（2）消化相关酶类，如淀粉酶等；（3） 脂类代谢相关酶类，如磷脂酶A1、阿朴脂蛋白酶等；（4）其他酶类，如过氧化物酶、 转移酶等。血蓝蛋白又称血清素，是存在于某些软体动物和节肢动物中的一种游离的蓝色呼吸 色素12。血蓝蛋白含两个直接连接多肽链的铜离子，它易与氧结合，也易与氧解离，是 已知的惟一可与氧可逆结合的铜蛋白，氧化时呈青绿色，还原时呈白色。它是在某些软 体动物、节肢动物（甲壳虫和蜘蛛）的血淋巴中发现的一种游离的蓝色呼吸色素。血蓝 蛋

7、白有多种催化作用，特别是变性后，在特定条件下具有多酚氧化酶、过氧化氢酶和脂 氧化酶等活性13。毒素相关蛋白中以黑寡妇蜘蛛中发现的 Latrotoxins （LTX）最著名。 它可以通过三种方式作用于细胞膜：一是它能通过钙离子依赖的方式结合突触前膜外生 蛋白，激活某种信号通路，从而释放突触小泡；二是它在其作用的细胞膜形成在一种非 特异性的孔道，使其允许钙离子和一些谷氨酸、乙酰胆碱等小分子量物质通过，进而引 起对靶细胞的伤害；三是它可以与GS白藕联受体2合，并通过GS白信号通路促使突触 小泡大量释放神经递质14。五、蜘蛛毒素的多肽类成分蜘蛛毒液中含量最丰富也是研究最多最深入的一类就是分子量在100

8、0到10000 Da的多肽类成分，一般含有3对或是4对的二硫键。目前已有成百上千种蜘蛛多肽毒素被 研究，它们的主要生物学功能是能够作用于靶体细胞膜上的各种离子通道，从而实现捕 食猎物和防御天敌的目的。六、多肽类蜘蛛毒素的研究现状通过对多肽组学的研究，在任意两种蜘蛛中没有发现有同一分子量和相同序列的多 肽，也没有在任意两种蜘蛛毒液中通过基质辅助激光解析离子飞行时间质(MALDI-TOFMS)发现到相同分子量的肽段。蜘蛛多肽毒素呈现出多样性，但是大多数的多肽类毒素 却主要集中在1到6 kDa。以中国虎纹捕鸟蛛为例，其多肽毒素主要集中在3到6 kDa15。根据多肽毒素的生物学功能主要可以分为三大类：

9、一是作用于靶细胞膜上的各种离 子通道，通过堵塞或强化离子流来使猎物或天敌麻痹甚至死亡。一般的多肽通常会作用 于多种不同类型的离子通道，如敬钊蜘蛛毒素 -V能作用Nav1.8和Kv4.316。二是作用 于神经递质受体，如芋螺毒素-GI能抑制乙酰胆碱与受体竞争性结合。三是作用于酶的 相关机制，如虎蛇可以分泌强烈的凝固剂、溶血素，被虎蛇咬后，除了伤口剧痛之外， 从伤口附近延伸的毒素更会令足部及颈部出现痛楚，身体感到麻痹、出汗，随即开始呼 吸困难及局部肢体瘫痪。而蜘蛛毒素按照功能和作用又可以分为神经毒、坏死毒和混合毒三种，其中神经毒 素占三分之二以上17。蜘蛛毒素的毒素作用是通过毒素分子与靶体细胞受体

10、的相互作用 完成的，尤其是通过各种离子通道来完成的。毒素的三维核磁共振解析和蛋白结晶的 X-衍射证明了蜘蛛的多肽毒素大部分是门 控修饰而不是直接堵塞门孔的方式来作用于离子通道的。在三维结构图上，毒素分子表 面大量的疏水性的氨基酸残基所形成的疏水斑片，其周围又分布着一些带电荷氨基酸残 基，这种特殊结构能与离子通道上的电压敏感元件相互作用，影响电压敏感元件的移动，从而影响离子通道的电流。七、作用于电压门控钠离子通道毒素电压门控钠通道(voltage-gated sodium channels VGSCs)是指在去极化电压诱导下才能被激活的钠通道。许多天然的钠通道毒素，大多数都是电压门控型毒素。VG

11、SCs广泛存在于中央与外周神经系统的神经元、肌肉以及各种可兴奋性细胞中，在各种神经 元的兴奋中发挥着关键作用。电压门控钠离子通道毒素能有目的性地选择和钠通道a亚 基的不同部位结合，而引起通道的动力学特征发生改变，如易化激活、阻塞通道口、慢 失活、通道去失活等。这些毒素的化学本质都为多肽类或有机小分子类钠通道毒素。其 中，多肽类钠通道毒素具有专一性强、活性高等优点。在目前的研究中，在哺乳动物神 经元钠通道上已经有六个部位能与上百种的毒素分子相结合。这些位点分布于细胞膜外 侧、通道孔内和跨膜区域上。这些电压门控钠通道部位依次被命名为位点1-位点6(Sitel-Site6),而结合于这些位点的毒素则

12、相应分别称之为位点1毒素(Site 1 toxin)-位点6毒素(site 6 toxin)。电压门控钠通道根据是否能被河豚毒素(TTX)阻断，又可 分为两大类：河豚毒素敏感型钠通道(TTX-sensitive , TTX-S)和河豚毒素不敏感型钠 通道(TTX-resistant, TTX-R )。八、作用于电压门控钾离子通道毒素钾离子通道(voltage-gated potassium channels VGPCs)相对其他离子通道研究得 最早，也最为通彻。电压门控性钾离子通道在调节静息电位、细胞膜的复极化等重要的 细胞生理过程有着重要的作用。钾离子通道结构域相对简单，它主要是由两型功能域

13、组 成的：即由S5至S6跨膜螺旋片段通过四聚排列构成的中央孔域和由S1至S4跨膜螺旋片段构成的电压敏感域。电压门控钾通道也可分为三种类型18：外向延迟整流钾通道(Kr),瞬时外向钾通道(KA),内向整流钾通道(Kir)。目前在蜘蛛中发现的钾离 子通道抑制剂主要作用在 Kv2( shab-related K+ channels) 和 Kv4( shab-related Kh channels)。 例如，最早从蜘蛛毒液中分离的hanatoxin-I (HaTx1)是一种可以抑制钾离子通道多肽 毒素，它由35个氨基酸残基折叠成抑制剂胱氨酸结构模体(ICK motif)。它对Kv2.1 钾离子通道表现

14、出很高的亲和性，而对 Kv1、Kv3钾离子通道没有作用，对于 Kv4只有 较弱的抑制作用。目前hanatoxin-I是研究Kv2.1离子通道的一个常用试剂。hanatoxin-I 能够结合电压敏感元件S3b-S4的跨膜螺旋所形成的电压敏感浆叶结构，并形成稳态复 合体，它的持续作用时间比电压敏感元件从负电位时的静息状态转变成正电位时的活化 开放状态的时间要长得多。通过定点突变技术证实了Kv2.1离子通道的I273、F274和E277很有可能是hanatoxin-I的结合位点19。钾离子通道(尤其是电压门控的钾离子通道)的多样性在调节神经细胞膜兴奋和神 经可塑性中起着关键的作用。钾离子可通过 K+

15、1道蛋白迅速地透过细胞膜，这一透过过 程包含了许多既是最基本又是较复杂的生物过程。钾通道的门控特性 （通道孔的开闭虽 然不同，但是他们具有相似的通透性。所有钾通道具有 k+r6c6的选择性通透序列，对 小分子碱金属nW与Li+的通透性更小。钾通道的一个通透特性就是多离子电导机制 ，这 一机制可导致异名电导特性。九、已研究的敬钊毒素概况敬钊缨毛蛛（Chilobrachys jingzhao）是我国海南省琼中县发现的蜘蛛新种。从 2002 年起，廖智等人从毒素学的角度对敬钊蜘蛛毒素进行系统研究。他们从敬钊蜘蛛毒素的 多肽成分中，提取60种多肽进行了序列测定。其中有31条多肽测定了全序列，另外29条

16、 测得了 NS部分序列。通过质谱分析发现，在测得全序列的 31个多肽分子中，29条多肽 含有6个半胱氨酸，形成3对二硫键。另外两个多肽则含有8个半胱氨酸，形成4对二硫键。 在这31条多肽中，其中有11个存在洲酰胺化修饰。后来陈金军等人通过转录组学的方 法在敬钊缨毛蛛毒腺中发现了 104个富含二硫键白毒素序列和115个细胞功能相关蛋白。 通过转录组与多肽组的数据比较，其中有 34个毒素是都能鉴定到的。其他一些毒素不能 在两个库中同时存在的原因可能有：（1）两种方法的取材不同。毒素组取材是同种蝴 蛛的混合毒素，而转录组的蜘蛛毒腺取材于基本上是年龄和状态相近的八只蜘蛛。（2）核酸和蛋白质检测的方法不

17、同。蜘蛛毒液中至少含有 200多个多肽毒素，目前利用传统 的分离方法，只能得到一些丰度较高的多肽，相当多的丰度偏低的多肽在分离和纯化的 过程中会损失殆尽。而核酸可以复制，根据 cDNAC库的结果，可以发现更多的毒素的序 列数目和更多低丰度蛋白的信息。此外，在敬钊缨毛蛛毒液中还发现了与喋吟、多胺、 烟酰胺代谢相关的酶。参考文献：1孔天翰主编.蝎与虫曷毒M,郑州:河南科技出版社,1995, 291.2萧熙.动物药的临床应用J.中医杂志,1986, 4: 15: 132.3刘崇铭，裴国强.东亚钳蝎的镇痛作用研究J. 1989, 3: 176.4王永奎，韩雪飞.蝎毒素-IV在大鼠脊髓中的镇痛作用及其机

18、理的研究J.河南医科大学学报，1996, 31 (3) : 56.5王成裕,雷留根，韩雪飞等.河南医科大学学报J. 1996, 31 (3):12.Davis JH, BradLy EK, MiLinch GP et aL. SoLution structure of-conotoxinMVIIA using 2D NMRspectroscopy and reLaxion matrix anaLysisJ. Biochemistry, 1993, 32: 73-96.Kohno T, Kim JI, Kobayashi K, etaL.Three-demensinaL structure in

19、 soLution of the caLcium channeL bLocker -conotoxin MVIIAJ. Biochemistry, 1995, 34: 102-156.8陈时宏.新型镇痛药 心芋螺毒素的合成等效物ZiconotideJ.中国新药杂志，2005, 14(4): 490-495.9梁映霞，赵树进.疼痛相关受体和离子通道及其应用J.广东医学报，2008, 29 (1): 154-155.10程志军，王英伟.钠离子通道亚单位与神经性疼痛J.上海交通大学学报(医学版),2006, 26 (3):318-320.11黄惟德,陈常庆多肽合成M.北京：科学出版社,1985, 1

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23、毒素与虎纹捕鸟蛛非肽类毒素的结构与功能研究D.长沙：湖南师范大学,2003.23陈冉冉，王贤纯，梁宋平.虎纹捕鸟蛛毒素-IV突变体 K27A-HWTX- IV的合成和复性及其生物学 活性的研究J.湖南师范大学自然科学学报，2003, 25: 115-117.24池宇朋，邓梅春，曾雄智等.两种敬钊蜘蛛毒素的结构与功能研究D.长沙：湖南师范大学2010.毕业设计（论文）开题报告2.开题报告：一、课题的目的与意义；二、课题发展现状和前景展望；三、 课题主要内容和要求；四、研究方法、步骤和措施开题一报告一、课题的目的与意义目的：JZTX-XI是从敬钊缨毛蛛毒液中分离到的一种多肽毒素 ，是一种瞬时外向钾

24、离 子通道抑制剂，可以强烈抑制 Kv2.1钾离子流，同时对Nav1.5也有抑制作用，通过对敬钊 缨毛蛛天然毒素中分子JZTX-XI序列分析，我们已经知道其序列（ECRKMFGGCSVDSDCCAHLGCKPTLKYCAWDGTF ）及其二硫键的配对方式， 所以可 以利用固相合成的方法合成一些某些氨基酸取代的突变体，再纯化和氧化复性，并通过膜 片钳电生理实验鉴定其生物活性，找出影响其生物活性的关键残基，从而阐明一级结构和 功能的关系。意义：多肽的合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值。通过多肽 合成，可以解决科研过程中许多棘手的问题：多肽合成可以验证一个新的多肽的结构；用 于研究结

25、构与功能的关系；设计新的多肽；为多肽生物合成反应机制提供重要信息；改造 多肽分子；合成新的多肽药物等.通过人工合成JZTX-XI的突变体（M5A-JZTX-XI）,再纯化 和氧化还原复性，再借助膜片钳（patch clamp）测定该突变体的活性并与天然的JZTX-XI 进行比较，可以确定与生物活性相关的关键残基，从而揭示其结构与功能关系。 二、课题发展现状和前景展望JZTX-XI也是从敬钊缨毛蛛毒液中分离到的一种多肽毒素， 通过N-端Edman窜解法对 其测序，发现JZTX-XI是由34个氨基酸残基组成，其中包含有6个半胱氨酸。它与钾通道 毒素 Stromatoxin-1、Hanatoxin-

26、1 和 Heteroscodratoxin-1 有超过 70%勺同源性，与钠通 道毒素Toxin CcoTx3和钙通道毒素SNX-482有大约60%勺同源卜t （图1-3 A） 33。JZTX-XI的cDNAff歹1J有468个碱基对，由3非翻译序列，5非翻译序列和编码前体 分子的开放阅读框构成。JZTX-XI的开放阅读框编码86个氨基酸残基组成JZTX-XI前体。 JZTX-XI的成熟肽（34个氨基酸残基）前含一段信号肽区（21个氨基酸残基），以及一个 Pro区（29个氨基酸残基），另外还有两个额外的残基（-GK）,而这额外的残基能影响 多肽的翻译后修饰，它们往往是多肽毒素C-末端酰胺化的信

27、号。通过核磁共振技术的结构解析，发现 JZTX-XI的N端和C端，以及部分带电荷残基和疏水性残基的溶液可及性表面面积都在其氨基酸总面积的30犯上。6个Cys, Leu19,Gly20和Ala29九个残基组成一个疏水性的核心位于空间结构的内部，它的溶液可及性表面小于10%（图1-4 A） 。 JZTX-XI的6个Cys形成的三对二硫键，为1-4, 2-5, 3-6连接，三对 二硫键形成的节状结构对稳定分子的空间结构有非常重要的作用。它的这种分子结构属于典型的ICK模体结构。估计JZTX-XI与Kv2.1通道结合的关键残基可能是 M5 F6, W30 R3和K22 JZTX-XI 还具有抑制急性分

28、离的大鼠心肌钠通道电流的作用，IC50值为1.28以研hanatoxin1和SGTx1均未发现有钠通道抑制活性，这可能是 JZTX-XI的N端分布有R3 K4 D12和D14 这几个带电荷的残基。这几个带电荷的残基在空间分布上与6-ACTX-Hv1affi6-ACTX-AUa （两种钠通道毒素）具有拓扑学上的相似性。大鼠心肌钠通道主要是 Nav1.5 通道，故与Nav1.5通道结合的关键残基可能是 R3 K4 D12和D1441。 三、课题主要内容通过同源模建预测JZTX-XI的第5, 24,26, 27位残基为关键残基，本次实验分别选 取第5和24位作为突变位点，合成JZTX-XI的突变体M

29、5A-JZTX-XI和T24R-JZTX-XI;再通 过反相HPLCM化，质谱实验显示合成线性肽的分子量与理论分子量相符，证明合成是成 功的；将合成成功的线性分子，通过加入含有谷光甘肽的缓冲溶液进行氧化复性，探索了 氧化复性的最佳条件，通过质谱鉴定对复性好的突变体进行了确认。 四、实验工艺流程与操作步骤1、实验材料与实验仪器 实验材料9-方甲氧染基（FmoC氨基酸为Chemassist公司产品；Rink Resin树脂在天津南开 和成公司购买；还原型谷胱甘肽（GSH、氧化型谷胱甘肽（GSSG、三羟甲基氨基甲烷 盐酸盐（Tris-HCL ）、6-氯苯并三氮唾-1, 1,3, 3-四甲基月尿六氟磷酸酯（HCTU、二琉基乙烷、苯甲硫醴