第四章基因的转移与重组体的筛选和鉴定

1、第四章 基因的转移与重组体的筛选和鉴定第一节 转化基因片段在在体外只只是一段段核酸分分子，是是化学物物质，无无法表现现出遗传传物质的的生命活活性。只只有当其其存在于于活细胞胞后，生生命的特特征才能能充分展展示出来来。在分分子克隆隆实践中中，在体体外操作作的核酸酸分子只只有进入入细胞以以后才能能达到克克隆的目目的。一、 重组组DNAA分子转转入原核核生物细细胞1. 重组组质粒DDNA分分子转化化大肠杆杆菌转化（trranssforrmattionn）重组组质粒DDNA分分子通过过与膜蛋蛋白结合合进入受受体细胞胞，并在在受体细细胞内稳稳定维持持和表达达的过程程。转化不仅适适合于大大肠杆菌菌受体细细

2、胞，而而且适合合于枯草草杆菌和和蓝藻等等其他原原核生物物以及酵酵母等低低等真核核生物受受体细胞胞。（1）CaaCl22处理后后的细菌菌转化或或转染A、制备感感受态细细胞受体细胞的的细菌，经经一定浓浓度的冰冰冷的 CaCCl2（501000 mmmolL）溶液液处理后后变成。所谓感受态态细胞，处处在感受受态状态态的菌体体有摄取取各种外外源 DDNA的的能力。转化：感受受态的大大肠杆菌菌细胞捕捕获和表表达质粒粒载体DDNA分分子的生生命过程程；转染：感受受态的大大肠杆菌菌细胞捕捕获和表表达噬菌菌体DNNA分子子的生命命过程；好的感受态态细胞，每每微克的的超螺旋旋质粒DDNA可可得5107个转化化体

3、。B、细胞转转化（或或转染）的的具体操操作过程程： 将处于于对数期期的新鲜鲜培养物物于040000转/分离心心10分，回回收细菌菌细胞； 将细胞胞用0的0.11moll/L CaCCl2低渗溶溶液处理理30分钟钟，离心心回收细细胞，再再用适量量 0的0.11moll/L CaCCl2重悬细细胞，以以诱导感感受态产产生。 加入适适量DNNA，于于42 热处理理混合物物90秒，使使DNAA分子被被细胞吸吸收； 将混合合物快速速转到冰冰浴中，冷冷却12分，加加入适当当的培养养基，在在37 培养455分，使使细胞复复苏并表表达质粒粒所携带带的转化化基因； 通过选选择培养养基上平平板培养养，选择择转化体

4、体。 如果用用抗菌素素筛选转转化体，作作为对照照的受体体菌应该该在此培培养基上上不生长长。（2）电穿穿孔转化化法基本原理是是利用高高压电脉脉冲作用用，在大大肠杆菌菌细胞膜膜上进行行电穿孔孔（ellecttropporaatioon），形形成可逆逆的瞬间间通道，从从而促进进外源DDNA的的有效吸吸收。 受体细胞的的准备：当细菌菌生长到到对数中中期后予予以冷却却、离心心，然后后用低盐盐缓冲液液充分清清洗降低低细胞悬悬浮液的的离子强强度，并并用100%甘油油重悬细细胞，使使其细胞胞浓度为为3110100个mml，分分装，在在干冰上上速冻后后置于-70贮存。每每小份细细胞融解解后即可可用于转转化，有有

5、效期达达6个月月以上。（3）三亲亲本杂交交接合转转化大肠肠杆菌原理：是基基于非接接合型质质粒的迁迁移作用用（moobillizaatioon）而而建立的的一种DDNA转转化方式式。首先先将具有有接合转转化功能能的辅助助质粒转转移至含含有重组组质粒的的供体细细胞中，然然后将这这种供体体细胞与与受体细细胞进行行混合，促促使两者者发生接接合转化化作用，将将重组质质粒导入入受体细细胞。整整个接合合转化过过程涉及及到3种种有关的的细菌菌菌株，即即待转化化的受体体菌、含含有要转转化的重重组质粒粒DNAA的供体体菌和含含有广泛泛宿主的的辅助质质粒的辅辅助菌，故故称三亲亲本杂交交接合转转化法。尤其适用于于那些

6、难难以采用用Ca22+诱导导转化法法或电穿穿孔法等等进行重重组质粒粒DNAA分子直直接转化化的受体体菌。（4）转化化率的计计算及其其影响因因素转化率是指指DNAA分子转转化受体体菌获得得转化子子的效率率有两种表示示方式：A：以转化化子数与与用于转转化处理理的DNNA分子子数或质质量的比比率表示示B：以转化化子数与与用于转转化处理理的受体体细胞数数的比率率表示。以用于转化化处理的的受体细细胞数为为基数来来计算转转化率A：通过菌菌液ODD值测定定或细菌菌计数，计计算出用用于制备备感受态态细胞的的受体菌菌总数。B：计算转转化子与与受体菌菌的比率率。用于制备感感受体细细胞的菌菌液每毫毫升有551007

7、个菌菌体，则则4 mml菌液液有21088个菌体体，由此此菌液制制备成感感受态细细胞，通通过转化化处理，获获得10000个个转化子子，则转转化率是是1033（221008）5110-66。其含含义是每每个受体体菌细胞胞被转化化的概率率是510-6，或或者说，要要得到一一个转化化子，需需要21055个受体体菌细胞胞。每单位质量量的DNNA分子子获得的的转化子子数来表表示单位通常是是转化子子数每g DDNA分分子，如如每gg重组DDNA分分子获得得1066个转化化子，则则转化率率为1006个/ gg DNNA分子子。影响转化率率的因素素：分子量载体类型及及构型重组DNAA分子的的浓度与与纯度受体细

8、胞2. 重组组噬菌菌体DNNA子转转导大肠肠杆菌 转导（trranssducctioon）是是指通过过噬菌菌体（病病毒）颗颗粒感染染宿主细细胞的途途径把外外源DNNA分子子转移到到受体细细胞内的的过程。DNAA与外壳壳蛋白结结合成噬噬菌体颗颗粒，才才有转导导宿主大大肠杆菌菌的能力力。因此此重组的的DNNA必须须进行体体外包装装。所谓谓体外包包装，是是指在体体外模拟拟噬菌菌体DNNA分子子在受体体细胞内内发生的的一系列列特殊的的包装反反应过程程，将重重组噬噬菌体DDNA分分子包裴裴为成熟熟的具有有感染能能力的噬菌体体颗粒的的技术。 在在实验方方法上，体体外包装装包括两两个方面面：（11）包装装抽

9、提物物的制备备；（22）体外外包装过过程。二、重组DDNA分分子转入入真核细细胞1. 根癌癌农杆菌菌Ti质质粒介导导法农杆菌介导导的Tii质粒载载体转化化法是目目前研究究最多、机机制最清清楚、技技术方法法最成熟熟的基因因转化途途径。迄迄今为止止约80096的的转基因因植株都都是利用用农杆菌菌介导转转化系统统获得的的。农杆菌是一一类土壤壤习居菌菌，革兰兰氏染色色呈阴性性，能感感染双子子叶植物物和裸子子植物，而而对绝大大多数单单子叶植植物无侵侵染能力力。植物物受伤后后，伤口口处细胞胞分泌大大量的酚酚类化合合物，如如乙酰丁丁香酮（AAS）和和羟基乙乙酰丁香香酮（OOHAAs），它它们是农农杆菌识识别

10、敏感感植物的的信号分分子。具具有趋化化性的农农杆菌移移向这些些细胞，并并将其TTi质粒粒上的TTDNNA的转转移至细细胞内部部。根据据这一性性质，将将待转移移的目的的基因组组入Tii质粒载载体，通通过农杆杆菌介导导进人植植物细胞胞，与染染色体DDNA整整合，得得以稳定定维持或或表达。步骤：（11）外植植体选择择与预培培养；（22）接种种活化的的农杆菌菌工程菌菌；（33）共培培养；（44）选择择培养；（5）转化植株再生2. 高压压电穿孔孔法利用脉冲电电场将DDNA导导入受体体细胞的的方法叫叫做高压压电穿孔孔法。利利用这种种方法，可可以将DDNA导导入动、植植物及细细菌细胞胞。具有有简单方方便、对

11、对细胞毒毒性低以以及转化化效率高高等优点点。（1）标准准的操作作程序将高高浓度的的含有克克隆基因因的质粒粒DNAA加到原原生质体体的悬浮浮液中，然然后置于于20006000Vcm的的电场下下进行电电脉冲刺刺激。经经过如此此电穿孔孔处理的的原生质质体在组组织培养养基中培培养12星期期之后，选选择已经经捕获了了转化DDNA的的细胞，作作进一步步的继续续培养，以以便获得得再生植植株。应用这种方方法已成成功地转转化了玉玉米和水水稻的原原生质体体，其转转化效率率在01100之间间。（2）影响响电穿孔孔导入DDNA效效率的因因素： 外加电电场的强强度：22507500 Vcm较较宜； 电脉冲冲的时间间：2

12、001000mss；工作温度度：对不不同类型型细胞所所要求的的条件不不同，可可以在00至室温温（255）之间间进行选选择； DNAA的构象象和浓度度：线性性 DNNA比环环状 DDNA要要好，浓浓度控制制在1 400 ggmLL。工作缓冲冲液的离离子成分分：也对对其DNNA导入入效率发发生作用用，一般般用盐溶溶液悬浮浮细胞要要比用非非离子溶溶液更易易DNAA的导入入。3. 聚乙乙二醇介介导的原原生质体体转化法法这种方法常常用于转转化酵母母细胞以以及其他他真菌细细胞。活跃生长的的细胞或或菌丝体体用消化化细胞壁壁的酶处处理变成成球形体体后，在在适当浓浓度的聚聚乙二醇醇60000（PPEG60000

13、）的的介导下下，将外外源DNNA转化化入受体体细胞中中。4. 磷酸酸钙或DDEAEE一葡聚聚糖介导导的转染染这是将外源源基因导导入哺乳乳类细胞胞中进行行瞬时表表达的常常规方法法。将被转染的的DNAA同正在在溶液中中形成的的磷酸钙钙微粒共共沉淀后后通过内内吞作用用进入受受体细胞胞。对于于DEAAE-葡葡聚糖作作用的机机理尚不不清楚，可可能是其其与DNNA结合合从而抑抑制核酸酸酶的作作用或与与细胞结结合从而而促进DDNA的的内吞作作用。5. 原生生质体融融合通过带有多多拷贝重重组质粒粒的细菌菌原生质质体同培培养的哺哺乳细胞胞直接融融合。经经过细胞胞膜融合合，细菌菌内容物物转入动动物细胞胞质中，质质

14、粒DNNA被转转移到细细胞核中中。6. 脂质质体法将DNA或或RNAA包裹于于脂质体体内，然然后进行行脂质体体与细胞胞膜融合合将基因因导入。脂质体是由由磷脂组组成的膜膜状结构构，用它它包装外外源DNNA分子子，然后后与植物物原生质质体共保保温。于于是脂质质体与原原生质体体膜结构构之间发发生相互互作用，尔尔后通过过细胞的的内吞作作用而将将外源DDNA高高效地纳纳入植物物的原生生质体。这种方法具具有多方方面的优优点，包包括可保保护DNNA在导导入细胞胞之前免免受核酸酸酶的降降解作用用，降低低了对细细胞的毒毒性效应应，适用用的植物物种类广广泛，重重复性高高，包装装在脂质质体内的的DNAA可稳定定地贮

15、藏藏等。用用此法转转化水稻稻原生质质体的效效率可达达14，并得得到了转转基因的的再生植植株。7. 显微微注射法法借助显微镜镜将外源源DNAA直接注注射到受受体细胞胞的方法法。适用用于此种种方法的的植物样样品包括括原生质质体、游游离的细细胞，以以及诸如如愈伤组组织、分分生组织织和胚胎胎组织等等多细胞胞结构。在显微注射射的实际际操作中中，受体体细胞或或组织是是被固定定在褐藻藻酸钠或或琼脂糖糖等特定定载体上上，然后后通过显显微操作作器，将将转化的的外源DDNA直直接注射射到受体体细胞核核中去。由由于一些些重要的的禾本科科粮食作作物均为为单子叶叶的，在在原生质质体再生生和Tii质粒的的转化方方面都存存

16、在着相相当的困困难，所所以对此此类植物物来说，DDNA的的直接注注射法具具有特别别重要的的实用价价值。本法的一个个突出优优点是转转化频率率高，可可达600以上上，但操操作困难难，需要要经过特特殊训练练的专门门技术人人员才能能迸行。8. 颗粒粒轰击（ppartticlle bbombbarddmennt）技技术颗粒轰击技技术是将将基因转转移到细细胞或组组织中去去的通用用方法，也也就是平平常所说说的用基基因枪实实现基因因转移的的方法。将DNA包包被在金金或钨的的微粒中中，然后后用基因因枪将DDNA包包被的颗颗粒直接接转移到到原位组组织、细细胞乃至至细胞器器中去。这这一技术术目前广广泛用于于植物基基

17、因工程程、基因因治疗以以及基因因（DNNA）免免疫等研研究。生物弹击法法的操作作对象可可以是完完整的细细胞或组组织，突突破了基基因转移移的物种种界限，也也不必制制备原生生质体，实实验步骤骤比较简简单易行行，具有有相当广广泛的应应用范围围，已经经成为研研究植物物细胞转转化和培培养转基基因植物物的最有有效的手手段之一一。第二节 基基因重组组 将目的基基因插入入载体的的过程，即即基因重重组（ggenee reecommbinnatiion)，其基基本过程程包括：首先在在目的目目的基因因和载体体两端造造成切口口，然后后依赖于于双链DDNA粘粘性末端端单链序序列的互互补结合合和DNNA连接接酶将切切口补

18、上上。这一一步的实实质就是是将两种种DNAA在体外外进行酶酶促连接接，最终终获得一一个重组组子。一一般连接接反应中中外源DDNA与与载体的的比例采采用3：1，44：1或或5：11。不同来源、性性质的外外源片段段采用的的连接方方式不同同。常采采用的连连接方法法有：粘粘末端连连接、平平端连接接法、人人工接头头法和同同聚物接接尾法。粘末端连接接 1. 全全同源粘粘性末端端连接 如果果目的序序列与载载体两端端具有相相同的限限制内切切酶位点点，则同同一限制制性核酸酸内切酶酶酶切后后在目的的基因与与载体两两端产生生完全相相同的粘粘性末端端，在降降低温度度退火时时，能重重新互补补结合，在在DNAA连接酶酶催

19、化下下，目的的序列与与载体DDNA连连接，实实现基因因重组，称称为全同同源粘性性末端连连接。另另外，不不同的限限制性内内切酶，如如果产生生的粘性性末端相相同，也也同样用用此方法法连接。该连接方法法的优缺缺点为：优点：该方方法是最最方便的的克隆方方法，其其连接效效率高，一一般采用用低浓度度酶在低低于166度，高高浓度AATP的的情况下下进行连连接。缺点：容易易出现载载体自身身环化、双双向插入入（即目目的基因因以两种种方向插插入载体体和多拷拷贝插入入的现象象，从而而在转化化后出现现高背景景，使得得筛选更更为困难难。双向向插入尽尽管对基基因克隆隆无影响响，却会会影响基基因的表表达。采采用碱性性磷酸酶

20、酶事先对对载体DDNA进进行去磷磷酸化处处理，可可有效避避免载体体自身环环化现象象；建立立连接体体系时，若若将目的的基因和和载体DDNA的的摩尔数数控制在在233：1，则则可有效效减少多多拷贝插插入的问问题。定向克隆使目的基因因按一定定的方向向插入载载体的克克隆方案案称为定定向克隆隆。最常常用的定定向克隆隆方案使使用两种种限制性性内切酶酶切割载载体和目目的基因因，从而而在载体体和目的的基因两两端产生生非同源源互补的的两个粘粘性末端端。定向向克隆也也可以通通过在一一端造成成平端，另另一端产产生同源源粘性末末端实现现年-平平连接。定向克隆有有效的限限制了自自身环化化，并且且实现了了目的基基因的定定

21、向插入入，在基基因克隆隆，尤其其是表达达某一基基因时，极极为有用用。定向向克隆的的连接体体系与相相应的粘粘性末端端或平末末端连接接相同。平末端连接接 T4DDNA连连接酶能能催化限限制性内内切酶切切割产生生的 DDNA平平末端进进行连接接。如果果目的序序列和载载体上没没有相同同的限制制性内切切酶位点点可供使使用，用用不同的的限制性性内切酶酶切割后后的粘性性末端不不能互补补结合，则则可用适适当的酶酶将粘性性末端变变为平末末端，再再用T44DNAA连接酶酶。 平端连连接比粘粘性末端端连接效效率低很很多，但但具有普普适性，可可适用于于任何DDNA片片断间的的连接，是是非常有有用的基基因克隆隆策略。另

22、另外，平平端连接接还常用用于将人人工合成成的人工工接头连连接到DDNA末末端，为为进一步步的克隆隆奠定基基础。 平平端连接接的主要要缺点是是连接效效率低和和存在多多拷贝的的插入，为为此，在在平端连连接时。需需采用高高浓度的的DNAAA和连连接酶，同同时，在在连接体体系中加加入低浓浓度的聚聚义二醇醇类物质质，也可可有效提提高连接接效率。多多拷贝插插入的缺缺点。可可通过控控制插入入片断与与载体的的墨尔比比解决。同聚物加尾尾同聚物加尾尾法就是是利用末末端转移移酶分别别在载体体分子及及外源双双链DNNA片段段的3末端各加加上一段段寡聚核核苷酸，人人工制成成粘性末末端。外外源DNNA片段段和载体体DNA

23、A分子要要分别加加上不同同的寡聚聚核苷酸酸。这种种方法的的核心是是利用末末端转移移酶的功功能，它它能够催催化脱氧氧核苷三三磷酸逐逐个地加加到DNNA分子子的3-OH末末端，反反应中不不需要模模板的存存在，44种dNNTP中中的任何何一种都都可以作作为它的的前体物物。因此此，当反反应混合合物中有有一种ddNTPP时，就就可以将将核苷酸酸转移到到双链DDNA分分子的突突出或隐隐蔽的33-OHH上，行行程仅由由一种核核苷酸组组成的尾尾巴。人工接头连连接法人工接头连连接法可可分为两两种：一一种为DDNA连连接法（llinkker）,另一一种是DDNA 接头法法(addaptter)。1. DNNA连接

24、接子法：DNAA连接子子是一段段人工合合成的具具有平头头末端的的双链寡寡聚脱氧氧核苷酸酸片断，长长度一般般为812个个，其上上有一个个或数个个限制性性核酸内内切酶的的识别位位点。由由此可以以看出，DNA连接子的作用主要是在DNA末端天加一个限制性内切酶识别位点，已产生粘性末端，已利用DNA片断连接。主要使用于对平末段的改造和连接。2. DNNA 接接头法: 尽管管DNAA人工连连接子技技术具有有许多优优越性，但但也存在在一些弊弊端。如如靶DNNA内部部含有与与连接子子相同的的识别序序列时，在在进行限限制性核核酸内切切酶切割割之前，必必须进行行甲基化化，以保保护靶DDNA不不被破坏坏。这一一系列

25、步步骤，使使得DNNA连接接子技术术操作较较为烦琐琐。DNA接头头是一段段人工合合成的一一端或两两端为粘粘性末端端的DNNA序列列，其中中包含一一个至多多个限制制性核酸酸内切酶酶位点。接接头法克克服了连连接子仅仅适用于于平端改改造的缺缺点，可可以平端端与目的的基因连连接，也也可以粘粘性末端端与目的的基因连连接。T-A克隆隆 目目前T-A克隆隆是用来来直接克克隆PCCR产物物的方便便方法。其其原理是是：由于于TaqqDNAA聚合酶酶在扩增增目的基基因的同同时，可可以不依依赖于模模板而在在产生的的两端加加上两个个游离的的“A”，因而而只要载载体切口口处人工工加上游游离的“T”，PCCR产物物即可与

26、与载体连连接。TT-A克克隆载体体已被广广泛应用用，并已已成为商商品化载载体。 第三节 克克隆的筛筛选与检检测在基因克隆隆、DNNA文库库制备过过程中，外外源DNNA与载载体连接接、载体体转化宿宿主细胞胞或体外外包装的的载体中中，往往往有一部部分是没没有外源源DNAA的，来来自自我我载体的的空荷载载体。如如何从克克隆的群群体中排排除假阳阳性的重重组子，如如何从成成千万的的重组子子中筛选选出所需需要的目目的克隆隆，如何何证明选选择的克克隆含有有所需要要的目的的基因？所以筛筛选是克克隆目的的基因的的重要步步骤。筛筛选的目目的就是是挑选出出含有目目的序列列的重组组体。（一） 重重组克隆隆的初步步筛选

27、克隆的筛选选可以根根据载体体类型、受受体细胞胞特性的的变化、外外源DNNA分子子本身的的特性，采采用不同同的方法法。主要要有遗传传学检测测、物理理特性检检测、分分子杂交交以及免免疫学分分析等。从从初步筛筛选直到到分子杂杂交，进进一步到到DNAA测序和和基于蛋蛋白质功功能的分分析，使使得对克克隆的检检测逐步步深入、精精确。1. 重组组克隆的的遗传学学检测遗传学检测测方法是是重组子子筛选过过程中最最初的检检测步骤骤。重组组子的表表征来源源于载体体所携带带的标记记和重组组子结构构特性。根根据这两两类表征征对重组组子进行行初步筛筛选。重组子的筛筛选含有有两层含含义：（1）把携带有外源插入DNA片段的克

28、隆挑选出来；（2）把携带有特定外源插入片段的重组子挑选出来。(1) 抗抗药性筛筛选这是利用载载体DNNA上组组装的抗抗药性选选择标记记进行筛筛选的方方法。常用的抗生生素筛选选剂:氨苄青青霉素（amppiciilliin，Ap或Ampp）；氯霉素素（chlloraamphheniicoll，Cm或Cmpp）；卡那霉霉素（kannamyycinn，Kn或Kann）；四环素素（tettraccymiic，Tc或Tett）；链霉素素（strrenttomyycinn，Sm或Strr）。重组质粒DDNA携携带特定定的抗药药性基因因，转化化后赋予予受体菌菌在含有有相应抗抗生素的的培养基基上正常常生长，而而

29、不含此此载体的的DNAA的受体体菌不能能存活。在在质粒载载体中通通常使用用双抗药药性标记记。例如：以质质粒载体体pBRR3222为例，ppBR3322含含有Teetr和Amppr两个抗抗性基因因。非重重组的野野生型ppBR3322应应该表现现出对TTet和和Ampp两种抗抗生素的的抗性活活性。能能在其中中之一下下生长的的受体菌菌，说明明其受体体细胞已已被转化化。插入失活筛筛选法检测克隆载载体携带带有外源源DNAA的通常常方法是是插入失失活。经经过抗药药性筛选选获得的的大量转转化子中中既包含含所需要要的重组组子，也也包含非非重组子子。为了了进一步步筛选出出重组子子，可利利用质粒粒载体的的抗药性性

30、进行再再次筛选选。如：pBRR3222有四环环素抗性性基因（Tetr）和氨苄青霉素抗性基因（Ampr），在Tetr基因内有BamH和Sal两种限制酶位点，如果在这两个位点中有外源DNA插入，都会导致Tetr基因失活。将转化后的细胞分别培养在含氨苄青霉素和四环素的培养基中，便可检出转化子细胞。插入表达筛筛选法与插入失活活相反，插插入表达达法是外外源目的的基因插插入特定定载体后后，能激激活用于于筛选操操作的标标记基因因的表达达，由此此进行转转化子的的筛选。设设计载体体时，在在筛选标标记基因因前面连连接一段段具有抑抑制作用用的负调调控序列列，插入入外源DDNA将将使该负负调控序序列失活活，其下下游的

31、筛筛选标记记基因才才能表达达。例如如质粒ppTR2262有有一个负负调控的的cI基因因，当外外源DNNA片段段插入ccI基因因中的BBcIII或Hinnd IIII位位点，造造成cII基因失失活，位位于cII基因下下游的TTet基基因（受受cI基因因控制）因因解除阻阻遏而被被表达，转转化后的的重组体体细胞，在在含有四四环素的的平板中中可形成成菌落；而未被被酶解的的质粒，自自身环化化质粒的的转化细细胞及未未转化受受体细胞胞均不能能形成菌菌落。环丝氨酸筛筛选这种筛选方方法只使使用于抗抗四环素素的基因因插入失失活的重重组克隆隆筛选。如：四环素素抗性插插入失活活如果在Teetr上上插入外外源DNNA，

32、导导致四环环素抗性性基因失失活，可可用四环环素加环环丝氨酸酸平板培培养基选选择重组组克隆。Tetr失失活的菌菌生长被被四环素素抑制，不不被环丝丝氨酸杀杀死，保保留下来来； Tetr不不失活的的菌抗四四环素，能能分裂生生长，反反而被环环丝氨酸酸杀死。显色反应筛筛选法上面所述的的抗药性性等筛选选法是用用插入失失活原理理筛选重重组DNNA的方方法。对对菌落或或噬菌斑斑平板进进行影印印复制，通通过两个个平板的的比较，才才能辨别别插入失失活的表表型特征征。这给给筛选工工作带来来许多麻麻烦。显色反应可可以在平平板上或或膜上直直接显示示出重组组克隆，不不仅方便便而且灵灵敏。如如：在某某些载体体如M113噬菌

33、菌体载体体，pUUC质粒粒系列、pGEM质粒系列，它们的载体上都携带lac z基因一段序列，它编码-半乳糖苷酶的肽，而宿主细胞为lac zM15的突变株。当将上述载体的转化细胞培养在含有X-gal和IPTG平板中，由于基因内互补作用，产生有生物活性的-半乳糖苷酶，把培养基中的无色X-gal分解成半乳糖和呈蓝色的5-溴-4氯-靛蓝，使菌落呈蓝色。若将外源DDNA插插入到载载体上llac z 序列中中，使-肽基因因失活，失失去互补补作用，将将重组体体转化细细胞培养养在含有有X-ggal-IPTTG平板板上，菌菌落无色色。利用用-半乳糖糖苷酶显显色反应应即可挑挑选出含含有外源源DNAA重组体体的阳性

34、性克隆报告基因报告基因是是某种生生物的特特定基因因，装配配在载体体上成为为载体结结构的一一部分，具具有指示示的功能能。与抗抗药性基基因相比比较，报报告基因因作为筛筛选方法法有更高高的灵敏敏度和准准确性，在在基因工工程中的的重要性性要大得得多。报告基因的的表达产产物易被被检测，受受体细胞胞本身没没有这种种内源性性产物。通通过快速速测定，“报告”外源基因是否已经重组到载体中，判断外源基因是否已成功地导入宿主细胞（器官或组织），或者在宿主细胞中是否表达。细胞内报告基因产物常作为直接观察载体活动的指示分子。把已知的调控元件连接到报告基因上，控制后者转录活性，对细胞中基因调控和表达的变化作出应答反应，从

35、而直观地“报告”细胞内有关基因表达的信号传递。在基因工程程实验中中，选用用何种报报告基因因依赖于于所使用用的细胞胞和实验验的性质质，以及及相应检检测方法法的掌握握。选择择报告基基因的准准则包括括（1）报报告分子子（报告告基因的的产物）应应不存在在于原有有宿主细细胞中，或或者易与与内源性性基因产产物相区区别；（22）报告告分子应应该有一一个简单单、快速速、灵敏敏及经济济的分析析方法来来检测；（3）启启动报告告分子表表达应有有很宽的的信号范范围，以以便分析析启动子子活性的的幅度变变化；（44）报告告基因的的表达必必须不改改变受体体细胞本本来的生生理活动动。基因工程中中常用的的报告基基因：如：（1）

36、氯氯霉素乙乙酰转移移酶（cchloorapphennicool aacettylttrannsfeerasse，CATT）基因因氯霉霉素可选选择性地地与原核核细胞核核糖体550S亚亚基结合合，抑制制肽酰基基转移酶酶的活性性，从而而阻断肽肽键的形形成并最最终抑制制细胞生生长。 （2）-葡萄糖糖酸苷酶酶（-Gllucuuronnidaase，GUSS）基因因：一种种水解酶酶，转化化植物细细胞所产产生的-葡萄糖糖酸苷酶酶能够催催化某些些特殊反反应的进进行，通通过荧光光、分光光光度和和组织化化学的方方法对这这些特殊殊反应产产物的检检测即可可确定GGus报报告基因因的表达达情况，以以此区分分转化子子和非

37、转转化子。 （3）荧光光素酶（luciferase，LUC）基因一种源于萤火虫的动物蛋白基因产物，能够催化生物发光反应。 依赖于重组组子结构构特征分分析的筛筛选方法法（1）快速速裂解菌菌落鉴定定分子大大小 根据据有外源源DNAA片段插插入的重重组质粒粒与载体体DNAA之间大大小的差差异来区区分重组组子和非非重组子子 （2）限制制性核酸酸内切酶酶酶解分分析法不仅仅可以进进一步筛筛选鉴定定重组子子，而且且能判断断外源DDNA片片段的插插人方向向及分子子质量大大小等 将重组DNNA分子子限制酶酶切点图图谱与空空载体图图谱作对对比，根根据各种种酶切所所得DNNA片段段的大小小及变化化，即可可推测有有无

38、外源源DNAA的插入入，并确确定出各各插入片片段的相相对位置置。 （3）利用用PCRR方法筛筛选确定定重组子子利用合适的的引物，以以从初选选出来的的阳性克克隆中提提取的质质粒为模模板进行行PCRR反应，通通过对PPCR产产物的电电泳分析析来确定定目的基基因是否否重组入入载体中中。（4）DNNA序列列测定 最后为了确确证目的的基因序序列的正正确性，必必须对重重组体的的DNAA进行序序列测定定。4. 物理理检测法法（1）凝胶胶电泳检检测法质粒粒DNAA的电泳泳迁移率率是与其其分子量量大小成成比例的的。因此此，那些些带有外外源DNNA插入入序列的的分子量量较大的的重组体体DNAA，在凝凝胶中的的迁移

39、速速度，就就要比不不具有外外源DNNA插入入序列的的分子量量较小的的质粒DDNA来来得缓慢慢些根据据这种差差别，就就可以容容易地鉴鉴定出哪哪些菌落落是含有有具外源源NDAA插入序序列的分分子量较较大的重重组质粒粒。（2）R-环检测测法在临近近双链DDNA变变性温度度下和高高浓度（770%）的的甲酰胺胺溶液中中，即所所谓的形形成R-环的条条件下，双双链的DDNA-RNAA分子要要比双链链的DNNA-DDNA分分子更为为稳定。因因此，将将RNAA及DNNA的混混合物置置于这种种退火条条件下，RRNA便便会同它它的双链链DNAA分子中中的互补补序列退退火形成成稳定的的DNAA-RNNA杂交交分子，而

40、而使被取取代的另另一链处处于单链链状态。这这种由单单链DNNA分支支和双链链DNAA-RNNA分支支形成的的“泡状状”体，叫叫做R-环结构构。R-环结构构一旦形形成就十十分稳定定，而且且可以在在电子显显微锐下下观察到到。所以以，应用用R-环环检测法法，可以以鉴定出出双链DDNA中中存在的的与特定定RNAA分子同同源的区区域。目的克隆的的鉴定经过初步筛筛选获得得的阳性性克隆，下下一步必必须对带带有目的的序列的的克隆做做进一步步筛选和和鉴定。鉴鉴定一般般有几种种常用方方法：（11）分子子杂交；（2）免免疫学检检测；（33）DNNA测序序；（44）蛋白白质活性性筛选；（5）基基因互补补实验。分子杂交核酸分子杂杂交有多多种方法法：原位位杂交、点点杂交及及Souutheern杂杂交等。原理：带有有互补的的特定核核苷酸序序列的单单链DNNA或RNAA，当它们们混合在在一起时时，其相相应的同同源区段段将会退退火形成成双链的的结构。如如果彼此此退火的的核酸来来自不同同的生物物有机体体，那么么如此形形成的双双链分子子就叫做做杂种核核酸分子子。能够够杂交形形成杂种种分子的的不同来来源的DDNA分分子其亲亲缘关系系较为密密切