hiv1病毒载量测定及质量保证指引

1、病毒载量测定及质量保证指南（版）中国疾病预防控制中心年月、，.、刖 言随着病毒载量检测在艾滋病临床辅助诊断、抗病毒治疗监测及相关科研工作 中的广泛应用，我国开展该项检测工作的实验室日益增多。自年艾滋病实验室首 次引进病毒载量检测技术以来，截至年底全国已经配备台病毒载量检测仪，覆盖 疾控、医院、检疫、军队等系统，艾滋病流行重点地区及少数县级实验室均已配 备病毒载量检测仪，每年检测量已达万人份以上。由于病毒载量检测质量对艾滋 病的早期诊断及治疗有重要影响，因此急需加强该领域的培训和质量控制，规范 实验室操作，以保证检测结果的准确性和可靠性。自年开始实施病毒载量测定及质量保证指南（试行，以下简称指南

2、） 以来，参与病毒载量能力验证工作的实验室从年的家增加到年的家，占已开展 工作实验室的百分之九十以上。通过综合分析近几年能力验证发现的问题与检测 技术发展的实际情况，考虑各种试剂的检测要求，结合专家意见和一线实验室工 作人员的经验与需求，对本指南进行了适当修改、调整和补充，主要修改内容包 括：（）增加“人员要求”章节；（）修改“常用病毒载量检测方法”；（）修 改“病毒载量检测能力验证（）”；（）补充常见问题分析和处理等内容。修订后的指南共分八章，包括：总则，人员要求，实验室环境与设施， 样品的采集、处理保存运输，常用检测方法简介，室内质量控制，实验室检测能 力验证（），实验室生物安全，以及四个

3、附表。本指南在修改过程中，接纳了国内专家、同行的意见和建议，经过多次修改 编写成指南（）版。本指南由中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中 心艾滋病参比实验室组织有关专家撰写，由中国疾病预防控制中心批准执行，并 在病毒载量检测实验室网络内发布实施。由于国内各实验室条件不同，不能采纳所有实验室的建议，因此本指南主要 提出一些原则上的参考建议，其中定有不妥之处，希望广大同仁提出意见，以便 不断完善。1 / 28本指南在年颁布的指南（试行）的基础上修订，在此对编写试行版过程 中给予帮助的国际组织和专家表示感谢。对本次修订过程中提出建议的全国病 毒载量检测实验室基层工作人员表示衷心的感谢。本指南的解

4、释权属于中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心。本指南编写主持人：蒋岩本指南编写人员： 潘品良蒋岩 李敬云钟平尚红李太生李繁本指南审核咨询专家及技术人员：邵一鸣汪宁王佑春郭志宏肖瑶邱茂 锋邢文革姚均朱红秦光明徐建青本指南编写联系人：潘品良本指南适用于全国病毒载量检测实验室本指南编写单位：中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心本指南自发布之日实施，同时终止年颁布的病毒载量测定及质量保证指南 （试行）。2 / 28病毒载量测定及质量保证指南目录第一章总则第二章人员要求第三章实验室环境与设施第四章样品的采集、处理、保存、运输第五章常用检测方法简介第六章室内质量控制第七章实验室检测能力验证（）

5、第八章实验室生物安全附表 常见问题分析和处理附表病毒载量检测样品送检及接收单附表 病毒载量检测能力验证样品接收专用单附表病毒载量检测报告单参考文献缩略语3 / 28第一章总则意义病毒载量是指每毫升血浆中病毒颗粒的数量，是艾滋病防治工作中一项重要 的实验室检测指标。病毒载量检测主要用于抗病毒治疗监测，包括治疗时机判定、 治疗效果评估、耐药预警；还可用于感染的辅助诊断，包括窗口期、病程晚期、 婴儿感染、疑难样本等的诊断；也可用于血液筛查。为了保证检测结果的准确性 和可靠性，必须对开展病毒载量检测的实验室进行规范化管理和质量控制。 目的指导病毒载量检测工作，规范实验室质量控制与管理。适用范围适用于我

6、国开展病毒载量检测工作的所有实验室。4 / 28第二章人员要求病毒载量检测人员分为检验人、复核人、签发人。培训实验室在使用新方法前，须对技术人员进行上岗培训，获得资格后方可开展 相应工作。上岗培训内容至少应包括：检测相关基础知识，病毒载量检测技术及 管理要求，实验操作，质量保证与质量控制，生物安全。检验人进行病毒载量检测的人员须具有艾滋病检测实验室的上岗资格，接受过省级 以上的实验操作技术及艾滋病实验室生物安全培训及厂家的技术操作培训。所有 相关检验人员需经公司工程师操作培训，能独立熟练地操作，并经考核合格，持 证上岗。复核人、签发人应具备对检测过程进行分析、解决问题的能力。复核人负责对原始数

7、据查阅、 结果核对，签发人核实结果正确后对外签发报告。5 / 28第三章实验室环境与设施除了病毒载量检测仪器，合理地、充分地配备实验室环境、设施、辅助设备 是保证病毒载量检测质量的重要方面。实验室环境病毒载量实验室应符合分子生物学实验室基本要求，包括试剂准备区、样品 处理区、扩增产物分析区。实验室设置总体原则为各区独立、控制风向、因地制 宜、方便工作。具体要求：各区必须是相互独立的，有条件各区内可分别设置缓冲间，以保证不同区之间 完全分隔开。各区的仪器设备与各种物品必须为专用，避免交叉污染。试剂准备区和样品处理区内须保持低度正压（或常压）状态，使空气流向始终 由室内向外，以避免扩增污染物进入此

8、区域。扩增产物分析区内须保持低度负压状态，使空气流向始终由室外向内，以防止 扩增产物通过气溶胶流出，造成与其他区域的交叉污染。实验室可安装排风扇或 其他排风装置。扩增产物分析区可以设在远离其他各区的地方。工作时必须遵循单一工作流向，即只能从试剂准备区开始，到样品处理区，然 后到扩增产物分析区。实验室设施各种病毒载量检测方法除病毒载量检测仪外，还需要配备相应的辅助设备 才能完成检测。病毒载量检测实验室设备分布示意图提供为病毒载量检测实验 室不同区内必备的辅助设备及耗材。辅助设备应根据不同检测方法作相应变化。样品处理区：生物安全柜：二级离心机（，适合离心管）冰箱：，以下水浴箱：误差范围小于。C加样

9、器套（N、N、N）带滤芯的一次性吸头（无和酶），离心管（无和酶）及相应试管架6 / 28计时器旋涡振荡器：震动频率可调一次性工作服、帽、口罩、无粉手套和鞋套病毒载量检测实验室设备分布示意图病毒载量仪加样器离一、增产物分析区离 心 机 浴 箱 手 池生物安全柜加样器漩涡振荡器样品处理区冰实验台病毒载量仪加样器离一、增产物分析区离 心 机 浴 箱 手 池生物安全柜加样器漩涡振荡器样品处理区冰实验台冰箱试剂准备区注:箭头表示风的流动方向试剂准备区:超净工作台（或密闭工作台） 加样器套（.、注:箭头表示风的流动方向试剂准备区:超净工作台（或密闭工作台） 加样器套（.、u、U） 离心机（，适合离心管）

10、冰箱：，计时器旋涡振荡器，震动频率可调带滤芯的一次性吸头（无、酶）离心管（无和酶）及相应试管架一次性工作服、帽、口罩、无粉手套、鞋套 扩增产物分析区：病毒载量检测仪加样器套（u、u、u）7 / 28冰箱：,旋涡振荡器，震动频率可调一次性工作服、帽、口罩、无粉手套和鞋套带滤芯的一次性吸头（无、酶）8 / 28第四章样品的采集、处理、保存和运输样品的采集、处理、保存和运输要求保证满足不同病毒载量检测方法对样 品性质的，并保证生物安全。因此需按照所使用检测方法的要求严格执行抗凝、 分样时间、运输包装、保存温度、冻融记录。用于病毒载量检测的样品须采用 抗凝血浆。样品的采集采样器材：一次性抗凝真空采血管

11、、持针器、蝶形针等。抗凝剂：通常采用（乙二胺四乙酸）或（枸椽酸钠），须符合不同检测 方法对样品的要求。样品标识：在采血管上贴唯一性样品编号。样品采集量:通常采集全血，采集的样品量应与定量采血管的刻度要求 一致，避免血液凝固或稀释。样品混匀：采集血液后，立即轻轻上下颠倒抗凝管次，使血液与抗凝剂 充分混匀。其它信息：病毒载量检测样品送检及接收单（附表）的备注栏内需注明 采集对象的基本信息和流行病学资料、抗病毒药物使用情况、最近一次的实验 室病毒载量检测结果。样品的处理要求在采血后小时内离心样品，室温下使用离心力为（）离心分钟后，吸出 血浆，分装到无菌的聚丙烯螺口冻存管中，并注明分装时间，冻存管应提

12、前贴上 耐冻的样品编号标签。血浆样品不能灭活。做好样品处理记录，包括冰箱温度变化、样品存取。样品的保存保存条件：根据血浆检测时间而定，天内可在。C暂时保存，个月内应冻存于。C 以下，个月以上应置于以下。不能使用自动除霜冰箱。血浆样品冻融不应超过次。监控并记录保存温度以及样品状态的变化。防止样品变质、泄漏及污染。9 / 28样品的运输根据可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规 定的要求运输，并严格控制运输的冷冻状态，避免样品融化。样品的发送和接收发送样品时,需详细填写样品病毒载量检测样品送检及接收单（附表）。接收样品时，按病毒载量检测样品送检及接收单（附表）核对样品数量，检 查

13、样品状况。样品管破损造成样品溢出、出现明显溶血、凝血的样品，不宜作病毒载量检 测；如果样品已经融化，可以。保存并尽快检测，记录冻融一次。10 / 28第五章常用检测方法简介病毒载量检测根据方法的原理不同，分为不同系列仪器，目前常用的病毒 载量的测定方法有:核酸序列依赖性扩增（）技术，代表产品为实时荧光技术仪; 分枝信号放大系统（）技术，代表产品为分析仪；实时荧光定量扩增技术（）， 包括 检测系统、检测仪与国产试剂盒均属此类技术。. 核酸序列依赖性扩增（）技术最早产品为定量测定方法，已经被新一代实时分子信标定量扩增所取代。 所采用的技术是一种等温扩增系统，其扩增基础在于系统内的混合酶系统，此系

14、统内含有逆转录酶和多聚酶在体外模拟逆转录病毒体内复制过程。结合技术、核酸提纯技术与分子信标探针技术（）检测血浆中的水平。 这种结合方法使用实时扩增分析（），提高对诊断质量的要求。此方法可分为 三个步骤：核酸提取、扩增和等温检测。的检测是利用靶特异的分子信标进行， 分子信标的寡核甘酸片段包含一段可特异结合靶的序列。当互补链不存在时，分 子信标维持内部发夹结构，使猝灭基团处于非常接近荧光素的位置，荧光信号被 猝灭。当分子信标与互补靶序列结合，发夹打开释放荧光信号，报告靶序列的存 在。 使用两个不同的分子信标，一个是针对野毒株的扩增子，另一个针对内 标物（）的扩增子，各使用不同荧光染料（野毒株使用，

15、内标物使用），从而实现靶 序列和内标物两个扩增过程的各自跟踪。荧光信号的动力学分析可以显示野毒株 和内标物的转录速率，因此可以计算出原样本中含量。.分枝（）技术分枝测定技术基于其独特的信号放大系统，即分枝信号放大系统，为一个人 工合成的分枝，分枝的分枝可结合多个酶标记物，从而将病毒的信号放大，以便 进行检测。此检测系统不涉及核酸扩增反应。方法定量系统中没有内标记物，每 次实验设置一系列外部标记，通过实验样品反应强度与外部标记样品强度的比较 确定待检样品的病毒拷贝数。检测通常包括以下步骤：（）将患者血清或血浆连同含有特异的合成寡聚核 甘酸靶探针的裂解液加到微孔中；（）孵育，释放病毒核酸，降解酶或

16、使变性，然 后靶探针结合到靶或并固定在固相板上；（）冷却洗板；（）加信号放大探针（） 到各孔内；（）孵育，使杂交到靶探针的相应部位；（）冷却洗板；（）加标记探11 / 28 针到各孔内；（）孵育，使酶标记的探针杂交到上；（）冷却洗板；（）加化学发 光底物到各孔中；（）孵育，酶和底物相互作用，产生化学发光信号。发射的光 强以相对光量值（）表示。产生的光强直接与各样品中病毒或的拷贝数成正比。各 样品中病毒核酸的含量由与样品一同处理的标准所制作的标准曲线计算获得。病毒载量检测仪较在孵育、冲洗和加样步骤由手动操作转变为自动化，减少 污染，更便于操作节省实验时间。.实时（）荧光定量扩增实时荧光定量技术，

17、是指在反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累 实时监测整个进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。每个反 应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数值与该模板的起始拷贝数 的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐 标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表值）。因此，只要获得未知样品的值，即 可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。实时荧光定量扩增的实验检测过程可分为：（）样品制备，抽提和浓缩目标 分子，并除去可能存在的抑制因子。（），检测的产物使用荧光标记的寡核甘酸 探针。检测的原理基于荧光信号增长曲线与循环数相关。（）反应，病毒利用逆 转录酶将逆转录为，然后通过聚合酶对特定片段进行扩增。（）扩增产物的检测， 基于检测阈值的设定，当病毒载量高时，低循环数即能检测到荧光信号，当病毒 载量低时，高循环数时才能检测到荧光。循环数与样品病毒载量成线性关系。利 用标准品制作循环数与病毒载量的标准曲线就能对样品病毒载量进行定量检测。目前此原理已为多种病毒载量检测的的主要方法，包括 检测系统、检测 仪和国内产品凯杰、达安以