基因定量课件

1、基 因 定 量RNA丰度的检测方法Northern 印迹RNA狭缝印迹分析RNase保护测定法S1杂交定量PCR定量PCR定量PCR可分为四类非竞争性PCR竞争性PCRPCRELISA法 Real Time PCR一、非竞争性定量PCR基本原理 非竞争性定量pcr技术是用一种内源性标准作为对照来估计出一种特异性靶DNA或RNA分子相对含量的方法。基本试验步骤包括RNA提取、反转录、PCR、PCR产物的检测等。 内源性标准通常是管家基因序列，一般认为管家基因的mRNA在同一种生物的不同个体、不同发育阶段以及不同组织中的表达量变化相对稳定，故可通过比较靶序列与内源标准扩增产物的含量来对靶序列进行定

2、量。常用的内参有actin，GAPDH等。目的基因看家基因PCR循环条件的优化： 产物变化的敏感区出现在指数增长期，确保目的基因和内参照基因在尽可能相同的条件下、以相似的反应动力学在对数期内同时进行扩增是比较基因变化的前提。 cDNA在不同循环数下PCR产物变化的电泳图cDNA在不同循环数下PCR过程的动力学曲线PCR产物的检测方法a.聚丙烯酰氨凝胶电泳或琼脂糖电泳，同位素标记，放射 自显影；b.聚丙烯酰氨凝胶电泳或琼脂糖电泳，EB染色，凝胶成像分析系统进行数据处理；c. HPLC；d. 荧光标记法。二、竞争性PCR基本原理 选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管

3、中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数 。三、PCRELISA法利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物在固相板上被特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCRELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的 。四、实时PCR（Real Time PCR） 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光

4、基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 实时PCR与常规定量PCR的区别 由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。 相同模板在同一台PCR仪上进行96次扩增的扩增曲线图 终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性 。 一、SYBR Green的基本原理：

5、 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 优点缺点二、Molecular Beacons的基本原理：原理优点缺点三、TaqMan探针的基本原理TaqMan 工作原理TaqMan 工作原理我们的工作一、RNA提取及反转录二、传统的半定量PCR三、荧光引物作半定量PCR四、定量PCR一、RNA提取及反转录 处理时间（H）处理方式612244872144WSSV感染333333注射正常虾组织333333弧菌感染333333注射生理盐水3

6、33333空白对照333333血淋巴：每组取三个样品，分别提取RNA，并作反转录；肌 肉：每组取三个样品，提取RNA后等量混在一起作反转录。二、传统的半定量RT-PCR 目的基因：抗菌肽（Pnaeidin） 内参基因： GAPDHRNA提取反转录成cDNAPCR琼脂糖凝胶电泳VDS照相扫描分析数据处理，作出曲线流程三、荧光引物半定量RT-PCR 目的基因：抗菌肽（Pnaeidin） （正向引物标记FAM荧光基团） 内参基因： actin （正向引物标记FAM荧光基团）RNA提取反转录成cDNAPCR核酸测序仪进行电泳(GENSCAN-500)作出曲线流程数据的收集和分析试验结果试验结果试验结果

7、试验结果四、实时定量PCR目的基因：抗菌肽（Pnaeidin） 内参基因： 18s rDNA 仪器：ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System 试剂：TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit探针：TaqMan ProbeTarget gene Target gene: penaeidinUpstream primers (21bps), 5ATGCGCCTCGTGGTCTGCCTG3 Downstream primers (20bps), 5ACAGCAACGTCCAAACCGAC3Probe（24b

8、ps: 72-95）HEX5-CACACGCCCGATATCCAGACCACC-3 TAMARA ) penaeidin (189bps)：atg cgc ctc gtg gtc tgc ctg gtc ttc ttg gcc tcc ttc gcc ctg gtc tgc caa ggg caa aag ggt ggt tac aca cgc ccg ata tcc aga cca ccc tat ggg gga gga tat ggc aat gtt tgc act tca tgc cac gtt ctt acc acc tca caa gct cgt tct tgc tgc agt cg

9、g ttt gga cgt tgc tgtHEX: Endogenous geneEndogenous gene: 18s rDNAUpstream primers (25bps), 5 -TCT GCC CTA TCA ACT TTC GAT GGT A-3， Downstream primers (25bps), 5-AAT TTG CGC GCC TGC TGC CTT CCT T-3）136 bpProbe（26bps:69-95） (FAM)5TCAGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGC-318s rDNA (136bps)：TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAG

10、GTTAAACGCCTACAATGGCTATCACGGGTAACGGGGAATCAGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTFAM: fluorescent dyes 5-carboxyfluoroscein总 RNA 的制备 引物和探针的设计（ Primer Express Software v2.0） 引物用量优化 探针用量优化 模板用量优化 扩增效率检测 在96孔板上进行RT-PCR 反应 数据分析工作流程条件优化的结果试验结果PCR扩增曲线试验结果试验结果试验结果试验结果试验结果比较结论：W

11、SSV和弧菌感染后，对虾肌肉和血淋巴中抗菌肽的表达量均发生了相似的变化，但肌肉中的变化不像血淋巴中那样强烈；WSSV感染后抗菌肽的表达量迅速降低，然后马上回升，最后有降低，甚至到正常水平一下；弧菌感染后抗菌肽的表达量也有一个降低的过程，到24小时达到最低点，而后缓慢上升，一致超出正常水平，而且延续很长时间。定量PCR半定量PCR定量与半定量PCR之比较定量PCR半定量PCR定量与半定量PCR之比较定量PCR半定量PCR定量与半定量PCR之比较定量PCR半定量PCR定量与半定量PCR之比较对半定量PCR的评价a. 灵敏度高： mRNA表达定量是一种挑战性的RT-PCR，但是提供了超越传统RNA分

12、析方法的优点。RT-PCR比Northern印迹或核酸酶保护分析更灵敏，需要的RNA量及序列信息较少。 b. 操作简便： 不一定必须同位素，试验周期短。c. 误差较大： RT-PCR涉及两个酶反应，这会导致RT-PCR产物量的波动。RNA转化成cDNA的量会影响产量，样品间很小的差异会被转化成产物产量间很大的差异，变异系数通常达到1020。d. 重复性较差： 同一批样最好一次完成。 对定量PCR的评价a. 灵敏度高： 定量PCR具有比半定量PCR更为灵敏的检测能力，RNA的检出量未pg级。 b. 操作简便： 反转录、PCR、数据获得和分析可以一步进行，整个过程只需23个小时。c. 误差小： 解

13、决了终点检测的问题大大提高了定量PCR的准确性，可与Northern媲美。d. 重复性好： 但最好要求同一批样品在同一块板上完成。e. 绝对定量： 引入标准曲线后能够绝对定量。 f. 比较昂贵 半定量PCR和定量PCR的原理不同，但均能对基因的转录产物，即mRNA进行定量检测，因此能较好地反映基因的转录水平，尤其是对于在通常情况下不表达的基因，这两种方法能够很好地反映新的基因转录变化。但是，基因的转录，并不是基因表达的全部，转录后需要经过翻译及翻译后修饰才成为蛋白质，这个过程又受众多因素的影响。包括mRNA的加工，稳定性，翻译的效率，蛋白质合成后的修饰和运输等，最终都会影响蛋白质的水平。检测细胞内蛋白质的水平，有时也不能说明基因表达的水平，因为在通常情况下，细胞内存在蛋白贮备的情形，这些蛋白是在先前合成的，并不是新合成的，可能以蛋白原的形式存在，也可能以非活性的其它形式存在，在细胞功能需要的时候，经过化学修饰，如磷酸化而成为有活性的蛋白质，从而发挥相应的作用。例如抗菌肽，存在于血细胞质内，当有病原入侵，即可从细胞质释放到血淋巴中，并发生剪切等一系列变化，成为有活