蛋白质一级结构的测定方法

1、蛋白质一级结构的测定方法研究蛋白质的一级结构从确定组成蛋白质的单元结构氨基酸算起，已有150年的悠久历史， 直到1955年，Sanger首次阐明胰岛素的氨基酸排列顺序，为研究蛋白质的一级结构开辟 了道路，这在分子生物学的发展进程中是一个重要突破。目前关于核酸的一级结构研究，由 于Sanger等发明了加减法，可以得到了突飞猛进的发展。对此之下，关于蛋白质的一级 结构研究进展不如核酸迅速。但随着Edman液相自动顺序分析仪和固相顺序分析仪以及气 相色谱、质谱等方法的相继出现，结构分析的速度也显著加快，至今已完成近千种蛋白质的 一级结构分析。目前不仅样品用量减少，而且工作人员也大大减少。当年Sang

2、er分析胰 岛素用了整整十年的时间，今天运用自动化仪器，分析一个分子量在10万左右的蛋白质只 需要几天，可见新技术的应用和发展对科学发展起的促进作用，蛋白质一级结构测定方法的 综述及专著文献较多，这里只扼要加以概述。蛋白质分子的一级结构测定，概括起来包含多肽链的分离、降解、肽段的分离和顺序分析以 及一S S 定位等。多肽链的分离在测定一个蛋白质的结构以前，首先必须保证被测蛋白质的纯度，使结果准确可靠。其次要 了解它的分子量和亚基数，按照其亚基数将蛋白质分成几个多肽链。肽链的拆开蛋白质分子多肽链的连接有共价结合和非共价结合两种。要拆开以共价结合的-S-S-连接的 多肽链，必须采用的化学处理方法常

3、有：过甲酸氧化用氧化剂过甲酸断裂-S-S-0这个反应一般在0C下进行2小时左右，两个S就全部能转变 成磺酸基，这样被氧化的半胱氨酸称为磺基丙氨酸。如果蛋白质分子中同时存在半胱胺酸，那么也会被氧化成磺基丙氨酸。此外甲硫氨酸和色氨 酸也可被氧化，从而增加分析的复杂性。巯基乙醇还原利用还原剂巯基乙醇亦可使蛋白质的-S-S-断裂。当高浓度的巯基乙醇在pH8?条件下室温 保温几小时后，可以使-S-S-定量还原为垂H。与此同时反应系统中还需要有8摩尔脲或6 摩尔盐酸胍使蛋白质变性，多肽链松散成为无规则的构型，此时还原剂就可作用于-S-S-。 此反应是可逆的，因此要使反应完全，疏基乙醇的浓度必需在0.1-0

4、.5摩尔。Cleland试剂的还原作用Cleland s 指出二硫赤苏糖醇(dithioerythriotol)及二硫苏糖醇(dithiothriotol)在氧化 还原能力上是比较强的试剂，只要0.01摩尔就能使蛋白质的-S-S-还原，反应基本与疏基 乙醇相似，且在许多球蛋白反应中，可以不用变性剂。Cleland试剂首先与蛋白质-S-S-形成中间物，反应终了，还原剂被氧化形成一个稳定的六 环化合物，蛋白质则被还原。还原蛋白不稳定，SH基极易氧化重新生成-S-S-键。稳定SH基的方法有: (A)烷基化试剂使SH基转变为稳定的硫醚衍生物。如果碘代乙酰胺代替碘代乙酸，其产物S 羧氨甲基衍生物不带电荷

5、，磺代乙酸也可与组 氨酸、蛋氨酸和赖氨酸发生反应，但反应条件不同，可通过各种pH及反应时间进行控制。(B)氨乙基化蛋白质分子的几条肽链若以非共价健结合，则用尿素、盐酸胍等变性剂即可拆开。蛋白质的 多肽链被拆开后，将它分离纯化，一般多用凝胶过滤、离子交换、电泳等方法，兹不赘述。 分离纯化后的每条肽链还要进一步分析其末端。末端分析 其方法较多，这里我们只介绍较常用的几种。(1)N-末端测定A.二硝基氟苯法(FDNB，DNFB)： 1945年Sanger提出此方法，是他的重要贡献之一。DNP-氨基酸用有机溶剂抽提后，通过层析位置可鉴定它是何种氨基酸。Sanger用此方法 测定了胰岛素的N末端分别为甘

6、氨酸及苯丙氨酸。氰酸盐法：1963年Stank及Smyth介绍了一种测定N一末端的新方法。由于乙内酰脲氨基酸不带电荷，因此可用离子交换层析法将它与游离氨基酸分开，分离所得 的乙内酰脲氨基酸再被盐酸水解，重新生成游离的氨基酸，鉴别此氨基酸即可了解N-末端 是何种氨基酸。二甲基氨基萘磺酰氯法：1956年Hartley等报告了一种测定N-末端的灵敏方法，采用 1-二甲基氨基萘-5-磺酰氯，简称丹磺酰氯。它与游离氨基末端作用，方法类似于Sanger 的DNFB法，产物是磺酰胺衍生物。丹磺酰链酸具有强烈的黄色荧光。此法优点为灵敏性较高(比FDNB法提高100倍，样品 量小于1毫微克分子)及丹磺酰氨基酸稳

7、定性较高(对酸水解稳定性较DNP氨基酸高)，可 用纸电泳或聚酰胺薄膜层析鉴定。(2)C-末端分析肼解法：这是测定C-末端最常用的方法。将多肽溶于无水肼中，100C下进行反应，结 果羧基末端氨基酸以游离氨基酸状释放，而其余肽链部分与肼生成氨基酸肼。这样羧基末端氨基酸可以采用抽提或离子交换层析的方法将其分出而进行分析。如果羧基末 端氨基酸侧链是带有酰胺如天冬酰胺和谷氨酰胺，则肼解时不能产生游离的羧基末端氨基 酸。此外肼解时注意避免任何少量的水解，以免释出的氨基酸混淆末端分析。羧肽酶水解法：羧肽酶可以专一性地水解羧基末端氨基酸。根据酶解的专一性不同，可区 分为羧肽酶A、B和C。应用羧肽酶测定末端时，

8、需要事先进行酶的动力学实验，以便选择 合适的酶浓度及反应时间，使释放出的氨基酸主要是C末端氨基酸。氨基酸组成分析在进一步分析多肽链的氨基酸顺序之前，首先应了解它是由那几种氨基酸组成的，每种氨基 酸有多少?分析组成的方法有：层析法将多肽链完全酸水解成游离氨基酸，然后进行Dansyl标记，聚酰胺薄膜层析，此方法在蛋 白质结构分析中是一种超微量的分析术，但此方法用于定量分析尚不够准确。离子交换层析法Spaekman等发展了一种精确的氨基酸组分的定量方法。他们采用磺酸型的离子交换树脂， 这是一种高分子量的固体聚苯乙烯，带有大量的功能基团，磺酸基在低pH和低离子强度条 件下，根据氨基酸的酸碱性，氨基酸带

9、正电，于是替换下树脂上的Na+，借助静电作用而 结合到磺酸基上。由于各种氨基酸在树脂上的亲和力不同，因此当改变溶液pH和离子强度，便可依次将它们 洗脱下来而分开，并进行定量测定。在此基础上发展了氨基酸自动分析仪。随着科学技术的 日益进展，氨基酸自动分析仪在样品的用量，分离速度及检测能力上也有了很大的提高。目 前最好的仪器样品分析量只要几十Picomole,分析时间只要数十分钟，而且计算全部自动 化，给研究蛋白质一级结构带来了极大的方便。多肽链的降解多肽链的氨基酸组成往往是比较复杂，因此直接分析多肽的氨基酸顺序还是很困难的，多采 用将多肽链进一步降解成为更小的片段，然后再行分析。肽键的裂解是一级

10、结构研究工作中 的重要问题，它要求裂解点少，选择性强，而且反应产率高，目前主要有化学法和酶解法两 类。化学法漠化氰法 是最理想的化学方法，能选择性断裂甲硫氨酸所在的肽键漠化氢化学降解法其优点：一般蛋白质含甲硫氨酸较少，由此可获得大片段专一性强产率高达80%以上作用条件温和，在室温中用几到十几小时即可。部分酸水解法Sanger在分析胰岛素的一级结构中采用了此法，即用0.1N盐酸在110C或用6N盐酸在 37C水解。这种部分酸水解的方法特异性不强，因此对大片段的蛋白质和肽均不合适。羟胺法这种方法近十年来开始受人注意，羟胺能专一性地裂解Asn Gly的肽键，酸性条件下裂 解Asn-Pro肽键。已用于

11、某些蛋白质的分析。N-漠代琥珀酰亚胺法主要裂解Try处的肽键，五十年代研究较多。但由于它也能断裂Tyr His肽键，因此应 用不广。酶解法酶水解法较化学法具有更多的优越性，使用也更广泛。因其具有较高专一性，而且水解产率 较高，所以可以选择各种不同专一性的酶进行专一性的断裂。常用的酶有胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶。胰蛋白酶专一断裂Lys,Arg的羧基侧肽键，如果对Lys,Arg,CysH进行化学修饰可改变胰 蛋白酶的断裂性质。(1)赖氨酸的修饰。将Lys用顺丁烯二酸酐或甲基顺丁烯二酸杆修饰，则胰蛋白酶仅使Arg 肽键断裂。顺丁烯衍生物在中性pH下稳定，胰蛋白酶水解仅使Arg键断裂。

12、在酸性条件下顺丁烯衍 生物可脱去封闭，此时再行胰蛋白酶水解，则得赖氨酸为末端的多肽。下述为蛋白质中的赖 氨酸，经顺丁烯酰化作用后，被胰蛋白酶水解的例子。（2）精氨酸的修饰。精氨酸与1，2-和1，3-二羰化合物作用，缩合产物是一杂环化合物， 十分稳定。然后胰酶水解仅断裂赖氨酸残基末端的肽键（3）半胱氨酸的修饰。若肽链内Lys、Arg均较少，则为了增加胰酶的裂解点，可以将半胱 氨酸进行氨乙基化，其产物S 0 氨乙基半胱氨酸有类似Lys的结构，胰蛋白酶在水解 时，不能识别这微细的变化，从而在半胱氨酸处断裂。蛋白水解酶的专一性酶米源主要作用点其它作用点胰蛋白酶胰Arg，Lys糜蛋白酶胰 Tyr，Phe

13、，Trp Leu，Met，His，Asu，Gln弹性蛋白酶胰Leu，Ile，Ala其它等胃蛋白酶胃粘膜 Tyr，Phe，Trp，Met，Len Ala，Glu，Asp，其它等木瓜蛋白酶Papayplant木瓜植物Arg，Lys，Gly其它等嗜热菌蛋白酶嗜热解蛋白芽抱杆菌Leu，Ile，Phe Val，Tyr枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌芳香族及脂肪族残基肽链的裂解和重组大致有三种情况：一种是非特异性裂解，如酸水解。由于裂解的片段较小， 造成分离的困难。因此这种非特异性裂解对大分子肽链是不适用的。第二种是特异性裂解， 采用两种以上的专一裂解，然后进行组合，这种方法一般也适用于分子量小于5万的蛋白 质。第

14、三种是逐步的专一裂解，首先将某种氨基酸进行化学修饰，使水解酶专一断裂某一种 氨基酸，分成若干片段，然后解除化学封闭，再用此酶裂解，使曾被封闭过的氨基酸断裂。 目前倾向于采用这种裂解方式。肽段的分离大部分肽段的分离主要通过凝胶过滤法，由于大分子肽溶解度小。往往采用甲酸、醋酸、丙 酸等有机溶剂使之溶解。单用凝胶过滤法分离之肽一般纯度不高，常需辅以离子交换层析法， 大片段肽可用离子交换葡聚糖作载体，小肽则多用Dowex-50等树脂。小肽分离还常采用高压电泳与层析相结合的指纹图谱法，得到纯净肽。肽的顺序分析在蛋白质一级结构的测定中，肽的顺序分析是比较重要的一步。肽的顺序分析也有化学法和 酶解法两种。1

15、）化学法 Edman降解法这是目前用于顺序分析的最主要的方法。它的原理是从N端开始，逐步降解。将肽先与异 硫氰酸苯酯（PTH试剂）在pH8-9条件下作用，肽的NH2末端接到异硫氰酸苯酯的C原子 上生成苯异硫甲氨酰肽，简称PTC 肽，在强酸作用下，可使靠近PTC基的氨基酸环化， 肽键断裂形成苯氨基噻唑啉酮衍生物和一个失去末端氨基酸的肽链。此肽不被破坏，因而又 可出现一个新的N 一末端。重复以上的步骤，继续与PTH试剂作用，继续分析，苯氨基噻 唑啉酮衍生物很容易由有机溶剂抽提出来进行鉴定。但此衍生物很不稳定，在水中可转化为 稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸（PTH-氨基酸）。这些步骤通常称为Edman氏逐

16、步降解法。所 以可用来测定氨基酸的排列顺序。Edman降解法的优点是样品用量少，灵敏度高。PTH-氨基酸的鉴定可以用各种层析方法，如纸层析、薄层层析、气相层析和质谱法等，现 在多用高压液相层析法。虽然此方法具有很多优点，但是由于操作繁琐，工作量大，所以目 前有人根据Edman降解的原理作一系列改进。下面简单介绍几种方法1967年Edman及Begg介绍了一种Edman降解的液相自动分析装置，使顺序分析开 始走向自动化。将样品先在反应杯内旋转成薄膜，使之固定。然后与PITC试剂反应。再用 有机溶剂多次抽提除去过剩试剂，因而样品易丢失，且仪器昂贵，使用受到限制。1970年Laursen改进为固相氨

17、基酸顺序仪。此法样品用量少，检出灵敏，可分析20?0 肽，其原理是将肽共价结合到惰性支持物上，固定后装柱再行Edman降解。此法成功的关键是肽段的固定，目前采用C端a羧基固定法，重复法高，其中以高丝氨 酸内酯法及双异硫氰酯法(DITC)最好，固定率可达90-95%。另外也有从化学反应的角度考虑，试图改进Edman方法。1976年有人将异硫氰酸苯酯 的苯基改变为甲氨偶氮苯，试剂为甲氨偶氨苯 异硫氰酸盐(简称DABITC)。这是一种有色 试剂，产物DABIH 氨基酸呈桔黄色，因此鉴定时无需染色，用肉眼即可分辨。此方法灵 敏度很高，一次分析小肽段只要几个nanomole样品即可，是目前一种很可取的方

18、法。此 外也有人将异硫氰酸酯进行 35S标记，使分析样品更向微量化方向发展。2)酶解法肽谱重迭法分析肽段也可采用酶解法，利用专一性不同的两种酶将一个肽分别断裂成更小的寡肽，比较 两种方法所得之肽段的重复性，进行氨基酸顺序的装配。例如，有一个肽段，通过氨基酸组 成分析已知其为十肽，假如先以糜蛋白酶水解，则得到一套寡肽，再以胰蛋白酶水解此十肽， 得到另一套寡肽。分析结果如下：AlaPhe+GlyLysAsnTyr+ArgTrp+HisVal糜蛋白酶水解+肽(AlaPheGlyLysAsnTyrArgTrpHisVal) 胰蛋白酶水解AlaPheGlyLys+AsaTyrArg+TrpHisVal将

19、此两套寡肽可以做分析比较，因为十肽的N末端及C末端已事先测定分别为Ala及Val， 因此第一段寡肽必然是Ala,Phe。如此类推如下 寡肽号氨基酸组成部分顺序A-1 AlaPhaB-1 AlaPheGlyLysA-2GlyLysAsnTyrB-2AsnTyrArgA-3 ArgTrpB-3 TrpHisValA-4 HisVal+肽顺序AlaPheGlyLysAsnTyrArgTrpHisVal水解酶也可运用二肽酶，两组可用同一种酶水解如第一套肽是A梆，C将，E板，G桯 第二套肽水解则先将该肽段N端切去一个末位氨基酸，然后再开始二肽酶断裂，结果是A， B栈，D梁，F梧这样分析比较也可排列出肽段顺序。二硫键定位蛋白质分子不经任何处理，直接用酶水解，检出其中二硫键的肽段，然后将二硫键拆开，分 别测定两个肽的顺序，将此两肽结构与测出的一级结构比较，就能找出相应的二硫键的位置。含二硫键肽的检