临床免疫测定技术课件

1、临床免疫测定技术（各论）临床免疫测定技术课件1临床免疫测定技术（各论）临床免疫测定技术课件1凝集试验Widal reactionWeil-felix reactionWright test:布鲁菌病交叉配血试验临床免疫测定技术课件凝集试验Widal reaction临床免疫测定技术课件相关帮助需要相关抗体试剂的可以访问Fantibody全球抗体搜索引擎fantibody全球抗体搜索引擎是一个供公共检索的抗体数据库，其抗体信息数据来源于全球范围的研究机构与商业公司。该引擎由商品化抗体数据库与抗体应用评价数据库两部分组成，以帮助研究者更高效的寻找并评估该抗体的性能。全球抗体搜索引擎是继基因与蛋白数

2、据库之后更为复杂的应用型检索平台需要相关的实验室仪器设备、生物试剂、医疗器械、制药设备、医药原料、体外诊断试剂及耗材与技术服务信息的，可以访问探生网biomean进行咨询，期待您的加入临床免疫测定技术课件相关帮助需要相关抗体试剂的可以访问Fantibody全球抗体Widal reaction（试管内凝集反应）取：（1：10）待检血清3.0ml 生理盐水 3.0ml/管 释度1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 临床免疫测定技术课件Widal reaction（试管内凝集反应）取： 待测血清的抗体效价（滴度）： 即出现“+”凝集的最终血清稀释度临床免疫测定技术课件 待

3、测血清的抗体效价（滴度）：临床免疫测定血型鉴定（玻片凝集反应）（直接）YYY+抗A标准血清YYY+抗B标准血清 待测RBC待测RBCA型 B型临床免疫测定技术课件血型鉴定（玻片凝集反应）（直接）YYY+抗A标准血清YYY 乳胶凝集试验(间接)带现象Zone phenomenon前带prezone后带postzone临床免疫测定技术课件 乳胶凝集试验(间接)带现象临床免疫测定技术课件临床免疫测定技术课件临床免疫测定技术课件 1）正向间接凝集试验 (用抗原致敏载体-检测Ab) 2）反向间接凝集试验间接凝集(用抗体致敏载体-检测Ag） 3）间接凝集抑制试验 4) 协同凝集试验 (SPA抗体致敏-测抗

4、原)临床免疫测定技术课件 1）正向间接凝集试验临床免疫测定技 反向间接血凝试验(测Ag)1/21/41/81/161/321/641/1281/2561/5121/1024Pos.Neg.Titer648512232128324Patient12345678临床免疫测定技术课件 反向间接血凝试验(测Ag)1/21/41/8抗球蛋白抗体试验- commbs （抗RBC不完全抗体）A（间接法游离）B（直接法结合）：临床免疫测定技术课件抗球蛋白抗体试验- commbsA（间接法游离）B（直(In fluid phase )絮状沉淀试验：AgAb环状沉淀试验临床免疫测定技术课件(In fluid ph

5、ase )絮状沉淀试验：AgAb(In gel phase )single gel diffusion test 抗原浓度的标准曲线操作：抗体混于凝胶中 抗原加入孔内 抗原自由扩散 测定沉淀环直径 在标准曲线上查找 相应抗原浓度临床免疫测定技术课件(In gel phase )single gel dif影响因素:1.抗原分子量：与扩散速度、沉淀环反相关2.抗体种类：兔抗血清优于马、羊3.抗体稀释度：抗体浓度大沉淀环小4.扩散时间：抗原含量高，扩散时间长5.扩散温度：437内温度与扩散速度正相关6.琼脂板厚度：与沉淀环反相关临床免疫测定技术课件影响因素:1.抗原分子量：与扩散速度、沉淀环反相关

6、临床免疫测double gel diffusion test原理:将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶板的对应孔中，两者各自在凝胶中向四周自由扩散，当抗原与抗体相遇，在比例合适时形成沉淀线。临床免疫测定技术课件double gel diffusion test原理:临床琼脂双向扩散试验的应用1.检测未知抗原或抗体2.抗原性质分析 3.抗体效价滴定4.抗原或抗体纯度鉴定临床免疫测定技术课件琼脂双向扩散试验的应用1.检测未知抗原或抗体临床免疫测定技术1.检测未知抗原或抗体临床免疫测定技术课件1.检测未知抗原或抗体临床免疫测定技术课件A: 浓度Ag、Ab及扩散率近似；B：浓度Ag、Ab近似，扩散率AgAb

7、 ；C：浓度Ag、Ab近似，扩散率AgAbD：浓度AgAb，扩散率近似；E：浓度AgAb，扩散率AgAb ；F：浓度AgAb，扩散率AgAb ；临床免疫测定技术课件A: 浓度Ag、Ab及扩散率近似；临床免疫测定技术课件2.抗原性质分析临床免疫测定技术课件2.抗原性质分析临床免疫测定技术课件3.抗体效价滴定临床免疫测定技术课件3.抗体效价滴定临床免疫测定技术课件4.抗原或抗体纯度鉴定临床免疫测定技术课件4.抗原或抗体纯度鉴定临床免疫测定技术课件免疫浊度试验(略)免疫球蛋白的检测（简）临床免疫测定技术课件免疫浊度试验(略)临床免疫测定技术课件年 龄 IgG IgA IgM脐血 6.516.0 0.

8、010.04 0.251月 2.59.0 0.020.5 0.200.829月 2.09.0 0.040.8 0.251.01012月 2.910.7 0.150.9 0.351.515岁 3.412.4 0.151.6 0.452.0612岁 6.516.0 0.352.5 0.502.51260岁 6.516.0 0.403.5 0.503.0 健康人血清Ig含量（g/L）临床免疫测定技术课件年 龄 IgG 免疫固定电泳（测M蛋白）临床免疫测定技术课件 免疫固定电泳（测M蛋白）临床免疫测定技术课件CH50(complement hemolysis 50%).原理：组分和功能完整的补体系统能

9、使抗体致敏的羊红细胞（SRBC）发生溶血反应。在一定范围内，SRBC溶血程度与补体总活性成正相关。以溶血百分率作纵坐标，相应的血清量为横坐标绘图，在一个适当的、稳定的反应体系中，溶血程度与补体剂量依赖呈一个S形曲线 临床免疫测定技术课件CH50(complement hemolysis 5Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）原理（Principle）：将抗原或抗体结合到某固相载体表面，保持其免疫活性，测定时,把被测sample和conjugate按不同的步骤与固相载体上的immunosorbent反应。用洗涤的方法使与固相载体上形成的immunoc

10、omplex与其他物质分开，再加入酶反应substrate，经酶的催化作用后substrate变为有色产物。产物的量与标本中被检物的量直接相关。临床免疫测定技术课件Enzyme linked immunosorbent asELISA操作的基本步骤：标本的收集、运送和保存试剂准备加样温育洗板显色比色结果判断结果报告及解释临床免疫测定技术课件ELISA操作的基本步骤：标本的收集、运送和保存临床免疫测定1、标本的收集、运送和保存ELISA检测分析用标本 血清（浆） 特殊项目用： 唾液、脑脊液、尿液、粪便等ELISA检测分析的对象 病原体抗原/抗体 Tumor mark、hormone、cytoki

11、ne et al采集、运送与保存的注意点： 采集时间、运送条件、暂存点温度临床免疫测定技术课件1、标本的收集、运送和保存ELISA检测分析用标本 血可能影响测定结果的标本因素一、内源性（标本内） 类风湿因子（rheumatoid factor） 补体（complement） 异嗜性抗体（heterophilic antibody） 治疗或诊断用鼠抗体（抗鼠抗体） 自身抗体或溶菌酶等二、外源性（操作） 溶血、反复冻融 细菌污染 储存时间过长 标本凝固不全临床免疫测定技术课件可能影响测定结果的标本因素临床免疫测定技术课件对策： 1、稀释标本 2、改变选用的酶标抗体 3、预封闭（变性IgG） 4、加

12、入某些还原剂 5、血清标本的补体灭活（5630min） 6、选择包被或标记抗体如F(ab)2片段 7、用理化方法解离自身抗体 8、标本中添加Cu2+离子或卵白蛋白 等等临床免疫测定技术课件对策：临床免疫测定技术课件 2、试剂准备1、实验开始前，将试剂盒从冰箱取出置室温放置20min以上启用，谓平衡（balance）目的： 1）保证反应温度的一致性 2）去湿化，保证试剂浓度2、稀释液的质量和特殊试剂配制的要求临床免疫测定技术课件 2、试剂准备1、实验开始前，将试剂盒从冰箱取出置室临床3、加样原则：量准 操作规范量准移液枪的状态与正确使用操作规范 正确使用加样器临床免疫测定技术课件3、加样原则：量

13、准临床免疫测定技术课件3、加样操作规范 掌握操作要领 吸头与加样器上吸头套密闭 吸头进入液体的深度要适宜 放送液体注意角度（1040） 位置（下1/3） 速度（不宜太快） 关注加样器的状态临床免疫测定技术课件3、加样操作规范 掌握操作要领临床免疫测定技术课件临床免疫测定技术课件临床免疫测定技术课件4、温育（incubation）温育是ELISA检测反应中可能影响其检测结果的最为关键的一个因素。液相的待测抗原/抗体与固相的抗体/抗原反应需要一定的温度与时间，以保证结合反应充分。温育所需要的时间与反应温度成反比。温育温度：37、室温、43和28避免“边缘效应”。临床免疫测定技术课件4、温育（inc

14、ubation）温育是ELISA检测反应中可5、洗板（washing）通过洗涤将特异性结合与固相的抗原或抗体与反应温育过程中可能非特异吸附及游离的成分分离，完成固相免疫检测程序保证测定的特异性。洗涤液 :0.05% tween-phosphate-buffer saline pH7.4吐温-20(山梨醇-20)一种非离子去垢剂含亲水/疏水基团临床免疫测定技术课件5、洗板（washing）通过洗涤将特异性结合与固相的抗原或在洗涤中的作用是通过其疏水基团与被动吸附于固相载体上蛋白的疏水键相互作用以削弱之；同时通过其亲水基团结合液相中水分子的作用，促使非特异的蛋白质吸脱。吐温-20的浓度（2%）洗涤

15、用量与次数临床免疫测定技术课件在洗涤中的作用是通过其疏水基团与被动吸附于固相载体上蛋白的疏例：选择4条8孔的已包被抗原（HBsAg）ELISA板条每2条分别加同一份弱阳性和阴性样本然后按试剂盒的操作说明加conjugate、温育洗涤：1排4孔洗1次 4排4孔洗4次 2排4孔洗2次 3排4孔洗3次 8排4孔洗8次加底物，显色，比色评判原则- 阳性/阴性值保持最大不变的次数临床免疫测定技术课件例：临床免疫测定技术课件6、显色(Color is appeared)添加酶特异性底物(HRP- TMB/OPD)保证底物溶液的有效性(无色、避光、显色)反应温度（37、室温）反应时间（2530min）终止反

16、应（酸溶液-2mol/L sulfate acid）及时比色临床免疫测定技术课件6、显色(Color is appeared)添加酶特异7、比色 (By the plate reader)加酸终止显色反应后，比色测定前应振荡混匀测定时，要注意酶标仪的波长是否已调至合适比较好的酶标仪可选择单波长或双波长比色测定 所谓双波长比色，即在敏感波长（此时对所显色 具最大光吸收）如450 nm和非敏感波长（所测得 的光吸收为微孔板上的划痕、污迹以及指纹等所 致），最后从仪器得到的读数为在敏感波长测得 的吸光度与非敏感波长测得的吸光度之差。临床免疫测定技术课件7、比色 (By the plate reade

17、r)临床免8、结果判断临床ELISA检测的结果报告形式 定性（阴/阳） 定量（量值） ELISA定性测定的“阴性”和“阳性”的判断依据是试剂盒所确定的阳性判断值（cut-off）。ELISA定量测定的“量值”依据是试剂盒中所带标准品同时测定出的剂量反应曲线（标准曲线）。cut-off的建立(略)S/CO1时判为阳性S/N或P/N2.1阳性为临床免疫测定技术课件8、结果判断临床ELISA检测的结果报告形式 定性（阴/阳“灰区”（例-HBsAg）临床免疫测定技术课件临床免疫测定技术课件9、结果报告及解释结果报告根据测定性质，定性-阴性/阳性 定量-具体数值结果解释结合所测项目的相关知识（临床意义）

18、，考虑各种可能影响的因素（关注测定操作中的各环节，尤其是加样、温育和洗涤）临床免疫测定技术课件9、结果报告及解释结果报告根据测定性质，定性-阴性/阳例举：临床可能出现的问题及原因现象：1、相同的标本两次测定的结果不一致原因：加样/试剂量不准，板孔间有差异 加样过快，孔间发生污染 加错样本 加样/试剂时，落在非包被区 不同批号的试剂混用 温育、洗涤及反应时间不一致 孔内污染杂物 酶标仪滤光片不正确 血清分离不充分，纤维蛋白原或血细胞入孔 临床免疫测定技术课件例举：临床可能出现的问题及原因现象：1、相同的标本两次测定的现象：2、弱阳性质控样本检测不出原因：温育时间或温度不够，显色反应时间过短， 配

19、置缓冲液（洗涤液）的蒸馏水有问题现象：3、阳性对照不显色原因：漏加酶结合物 洗涤液配置？（含有酶抑制物-NaN3） 漏加显色剂，错加（将终止液误为显色液）现象：4、全部孔都有显色原因：洗涤不够 显色液变质 底物或洗涤液被酶污染临床免疫测定技术课件现象：2、弱阳性质控样本检测不出临床免疫测定技术课件 临床ELISA测定的常用模式一、双抗体夹心检测抗原二、竞争法检测抗原三、间接法检测抗体四、竞争法检测抗体五、固相捕获法检测抗体六、双抗原夹心检测抗体七、ABS- ELISA及其他临床免疫测定技术课件 临床ELISA测定的常用模式一、双抗体夹心检测抗原临床免一、双抗体夹心检测抗原例：ELISA双抗体夹

20、心法定性检测乙型肝炎表面抗原原理：临床免疫测定技术课件一、双抗体夹心检测抗原例：ELISA双抗体夹心法定性检测乙型AbAgAb* Ab Ag Ab* Ab Ag Ag Ab*Ab* Ag Ab* a b c d临床免疫测定技术课件AbAgAb* Ab Ag Ab* Ab Ab Ag Ab Ag （b复合物） (1) Ab AgAb* Ab Ag Ab* （a复合物） (2)临床免疫测定技术课件Ab Ag Ab Ag （b复合物） HooKS效应（钩状效应）临床免疫测定技术课件HooKS效应（钩状效应）临床免疫测定技术课件评价： 被检测的抗原具有两个以上抗原决定族（全抗原） 标本中RF会充当抗原

21、分子（干扰） 一步法简便、快捷；存潜在缺陷(hooks effect) 其他- 判断时OD值落在“灰色区”？ 假阴性？（ hooks effect /变异） 假阳性? 临床免疫测定技术课件评价：临床免疫测定技术课件二、竞争法检测抗原 例:T3、T4等激素或地高辛、茶碱等药物浓度检测临床免疫测定技术课件二、竞争法检测抗原 例:T3、T4等激素或地高辛、茶碱等药物评价： 结合于固相的酶标记抗原量与被测抗原量呈反比 检测对象为小分子蛋白（半抗原） 检测中需获得酶标记的小分子半抗原（制备难） 运用于仪器的自动化检测 临床免疫测定技术课件评价：临床免疫测定技术课件三、间接法检测抗体例:ELISA间接法检

22、测各类病原体特异性抗体（IgG）临床免疫测定技术课件三、间接法检测抗体例:ELISA间接法检测各类病原体特异性抗评价： 通用性大。只要更换固相抗原，同一种酶标记体 体（IgG/IgA、M）可用以各种与抗原相应的抗体检 测。 标本高浓度时易受非特异IgG的干扰（稀释） 易受其他因素的影响（包被抗原的纯度） 临床免疫测定技术课件评价：临床免疫测定技术课件四、竞争法检测抗体抗体的检测一般不选用竞争法。当已知抗原难以纯化或抗原/抗体的结合特异性不稳定时 实例-ELISA竞争法检测乙型肝炎病毒核心抗体 （基因工程表达的HBcAg） 固相板（包被HBcAg ）+ 待测标本 + 酶标记抗-HBc 待测标本中抗- HBc /酶标记抗-HBc （竞争）固相板（包被HBcAg ） |酶标记抗-HBc与固相板