发光方法课件

1、发光技术原理及在环境研究中的应用中国科学院生态环境研究中心环境水化学国家实验室常用的发光方法体系化学发光发光酶方法重组发光酶基因的工程菌方法发光菌方法化学发光分析中常用的发光体系鲁米诺发光体系（LUMINOL+H2O2）过氧草酸盐发光体系洛粉发光体系（LOPHINE）光泽精发光体系(LUCIGENIN)钌(II)-联吡啶配合物发光体系LUMINOL化学发光体系氧化剂鲁米诺催化剂+抑制剂Cu(II)Co(II)Zn(II).Cr(III).H2O2电极反应Fe(CN)53-胺氨基酸醇磷酯胆碱.用LUMINOL化学发光体系测定重金属浓度H2O2鲁米诺+Cu(II)Co(II)Zn(II).Cr(I

2、II).SO2+隐蔽剂体系对象生物发光体系RCHOFMNH2FMNRCOOHO2hv+ATPLuciferinOxyluciferinAMPO2hv+发光菌萤火虫细菌荧光素酶萤火虫荧光素酶590 nm560 nm水母发光蛋白蚯蚓发光体系生物发光体系的应用无细胞体系（发光酶）发光细胞体系（发光菌）闪烁记数器LUMINO光度计电荷偶合成象光子影象系统发光酶的核酸探针发光酶活性测定定量实时跟踪实时跟踪直接用萤火虫发光酶构建的典型发光体系荧光素氧化荧光素ATPAMP萤火虫荧光素酶测定不同体系中细菌数测定系统能量代谢改变利用生物发光方法分析食品中微生物含量采样过滤培养培养ATP提取发光Tanaka等发展

3、的快速微生物测定体系，1997发光酶提取剂高氯酸丁醇/辛醇加氯仿煮沸步骤费时，有干扰，适合野外使用加TRIS缓冲液煮沸提取速度快，增强荧光，稳定性差提取速度快，适合大批量样品操作稀释比较大，灵敏度受影响四种常用的ATP提取体系及优缺点能够降解苯系物的细菌(Pseudomonas putida)TOL 质粒萤火虫发光基因融合基因质粒 pTSN316 重组大肠杆菌苯系物专属型生物传感器插入到xylS蛋白启动子位置Kobatake, et al., Biosensors & Bioelectronics 1995， 10 ( 6-7): 601构造带有发光基因的微生物光功率计典型的细胞发光测试体系及

4、其应用Hind IIIHind IIIPS IIBamH ISall2000800060004000Luxgene (Q67)Reconstracted Plasmid with Luxgene from V. Qinghainesis Q67(PACYC L184, 9000 bps, for recombinants of TA98 and TA100)cml朱文杰等., 1999将含发光酶基因的质粒融合到细菌细胞中例：发光标记荧光假单孢菌研究农用稀土元素对土壤微生物的影响10000500菌密度稀土元素浓度黄褐土安徽农大未发表数据，19991005稀土元素浓度红壤用发光标记方法跟踪工程菌在

5、环境中的稳定性和分布特性用标记噬菌体监测宿主细胞种类和密度根据原生动物/微生物(发光标记)之间的捕/被食关系研究土壤微生物活性改变部分其他环境应用用接种发光标记微生物的方法研究植物根际动态用LUX报告基因融合方法研究化学品降解速率和途径法国：DM，Microtox，fish, Ames不明确控制标准德国：Fish，Microtox，Algae, Ames, DM用获得NOEC 的稀释倍数控制爱尔兰：Rainbow TroutTU1-25，取决于工业类型，每排放1TU需20倍稀释1995年欧洲部分国家毒性排放控制标准及实施细节（红色部分是计划1995年以后实施的项目）荷兰：急慢性毒性，可降解性，

6、致突变性，富集性仅针对典型工业污染评价英国： Microtox， DM，Oyster, Algae.对不同工业类型测试种和复杂性不同瑞典：多指标急慢性毒性，可降解性，致突变性，富集性针对工业类型分3个步骤挪威：多指标急慢性毒性，可降解性，致突变性以过筛方式为主加拿大：Microtox, DM, Algae, Ames美国：全排水毒性控制方案CMC和CCC国家环保局生物监测方法规范GB/T 12990-91水质: 微生物的PFU测试方法GB/T 15441-95水质: P. phosphoreum (T3) 急性毒性测试GB/T 13266-91水质: 大型蚤急性毒性测试GB/T 13267-9

7、1水质: 鱼(Pinto)急性毒性测试发光菌的分类(P. Baimann)将4保存的斜面菌种转接到新鲜斜面上22培养24h接种到50 mL液体培养基中22振荡（180r/min）培养1618h2000 r/min 离心10分钟收集菌体并用蒸馏水制成菌悬液调整菌液浓度取0.1ml菌悬液加入到0.9ml样品或空白溶液中混匀后反应20分钟，测样品和空白的发光强度利用发光菌测试毒性时一般操作规程CEC50发光抑制（%）Log CEC50发光抑制（%）Log 稀释度EC50发光抑制（%）Log CEC50Log 发光菌毒性实验中的剂量/效应关系Vibrio qinghaiensis sp. nov. Q

8、-67毒性测试方法的开发过程从青海湖裸鲤体表分离得到发光菌筛选出Q-67表型特性发光特性生理生化特性致病特性环境因素影响测试范围考察应用范围考察方法应用推广质量保证测试方法规范朱文杰., 1992;马梅,1998天然水体中阴(A)、阳 (B) 离子对Vibrio qinghaiensis sp. nov. Q-67发光的影响-300-200-1000100200-3-2-1012345Log Conc. ( mg/L)CaCl2KClMgCl2NaClRelative Luminescence (%)-200-150-100-5005010000.511.522.533.54Log Conc.

9、 ( mg/L)Na2SO4 NaCl NaHCO3NaNO3AB02468101214160102030405060反应时间 (min)EC50 (Cu-CuSO4, mg/L)1340万670万340万170万确定发光测试方法的实验条件：菌液密度和反应时间(pH was adjusted by 0.1 M NaOH or HCl, solution with pH 7 was used as control.)-20.00.020.040.060.080.0100.04567891011pH相对光损耗(%)确定发光测试方法的实验条件：pH的影响应用Q67发光菌测定不同金属离子的毒性Hg N

10、i Cd Cu Mn Zn应用发光菌研究复合污染过程的毒性变化重金属离子的联合毒性(Vibro Qinhainesis Q67测试，等毒性设计)Zn+HgCd+HgCu+HgCd+Zn+CuCd+ZnCd+Hg+ZnCd+CuCu+ZnCu+Hg+ZnCu+Cd+Hg11LCLCLCLCTEILCLC50exp50,A50,B50,N50exp50obs=+=-abn-122-1TEITEI刘清., 19972,5-DCP020406080100-1-0.500.512,3-DCP050100-1-0.500.513-CP05010000.511.522,4,5-TCP050100-2-1.5

11、-1-0.502,3,4,5-TCP-20020406080100-2-1.5-1-0.5应用Q67发光菌测定不同取代氯酚的毒性Log C (mg/L)童中华., 1997EC50= 3611e-2.4log P0246810121422.533.544.55log PEC50应用发光菌研究取代氯酚的结构/毒性关系 六种主要国产农药对Q-67和T-3 的毒性(mg.l-1)杀菌剂杀虫剂童中华., 19970100200300400500600700乙磷铝五氯硝基苯三唑酮涕灭威灭幼脲单甲脒Q67T3Q67和T3发光菌测定农药毒性的比较 14种主要国产染料对Q-67的毒性(mg.l-1)童中华.,

12、 1997204060801000306090放置时间(小时)相对毒性（%）还原深蓝VB还原直接黑向还原红应用发光菌研究电化学方法去除染料毒性的效果处理时间（分）童中华., 1997上海市地方标准：健康型建筑内墙涂料生物毒性指数（执行标准DB31/TXXX-1998,）将涂料按比例稀释(可使用适当助剂溶解)将涂料稀释成系列浓度用超声波匀浆器处理5分钟（4C，相对湿度40%）测定发光菌毒性测定发光菌毒性样品暴露1小时计算生物毒性指数DRT=(EC50-EC50)/EC50TIP=100(TU2+DRT2)1/2 EC50(mg/l)EC50(mg/l)DRTTUTIPA 102.00185.00

13、0.450.0145B 407.00515.000.210.0021C 489.00614.000.200.0020D 172.00345.000.500.0150E 229.00 444.000.480.0048F 374.00531.000.300.0030G 164.00344.000.520.0152H 116.00214.000.460.0146I 640.00671.000.050.005几种北京市场上销售的内墙涂料毒性测试结果（P. Phosphoreum T3)执行标准：TIP 10马梅., 1999海口盘龙庙沽口中洲戴村虎山蔡家湾洎水河黄龙庙L01L03L04L05L07L08L08L09洎水河口L06大坞河乐安江0102030405060708090100A01A04A05J.R.A07A08A13A14采样点相对抑制率（）T3Q67应用发光菌研究江西乐安江水质毒性的沿程变化J.R012A01A03A04A05J.R.A07A08A09A13A14毒性单位（TU）94.1093.6 应用发光菌研究江西乐安江水质毒性的时空变化海口盘龙庙沽口中洲戴村虎山蔡家湾洎水河黄龙庙L01L03L04L05L07L08L08L09洎水河口L06大坞河乐安江带有发光基因的固定化细胞光功率计放