实验七 植物总RNA的提取课件

1、实验七 植物总RNA的提取一、实验目的1. 总RNA提取的原理2. 通过本实验学习用试剂盒从动物鱼肝脏组织中提取总RNA的方法。 二、实验原理RNA是一类极易降解的分子。要获得完整的RNA必须在提取过程最大限度地抑制内源性及外源性RNA酶对RNA的降解作用。 通过高强度的变性剂使RNA酶失活，使RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，通过氯仿除去蛋白质和细胞碎片等杂质，从而得到纯化的总RNA。三、实验仪器、材料与试剂 仪器 1. 200以上烘箱 2. 低温离心机 3. 恒温水浴锅 4. 微量移液器 材料 1. 新鲜动物组织 2. 氯仿 3. 异丙醇 4. 乙醇 5. 焦碳酸二乙酯（DEP

2、C） 6. EP管等（50ml离心管 ）7. 陶瓷研钵、研棒 8. 一次性手套、（剪刀）等 试剂 Trizol试剂 四、实验步骤 称取100mg动物肝脏（1g新鲜植物材料），液氮研磨成粉末移入1.5mL EP管（50ml离心管）中。 加入1mL Trizol （10ml Trizol） 试剂， 充分混匀。样品体积不能超过Trizol体积的1/10。室温（15-30 ）放置5 min （4离心，12000 g，10 min；上清移入新管；18放置5 min以使核酸复合物分开）。4. 加入200 l （2ml）氯仿，迅速摇动15秒以混匀。 15-30 放置2-3 min。4（2-8 ）离心，120

3、00 g， 15 min (10 min)。 上清移入新管。加入0.5mL（ 1倍体积）异丙醇， 15-30 （18）放置10 min。 4 （2-8 ）离心，12000 g， 10 min。至少1mL 75%酒精洗涤沉淀1次： 2-8 ，7500 g，5 min。简单空气干燥一下，约5-10 minRNA溶于10-15 L DEPC 水中：Tip吹吸数次或55-60放置10 min。 放于-80（ -20）贮存或进行下一步实验。五、实验结果与讨论实验结果与讨论讨论附I ： Simply P 总RNA提取试剂盒(Simply P Total RNA Extraction Kit)济南朋远（Bi

4、oFlux）生物技术有限公司Website: 取新鲜植物材料100mg，于液氮中研磨成粉末，将其转到1.5mL EP管中。加100-150l 溶液RI。振荡混合30秒，室温静止1分钟。在处理好的样品中，加600l 溶液R2，充分颠倒混匀，室温静止3-5分钟。将上清转移到Spin Column管中，Spin Column管要套上离心管，离心30秒。弃取外管套中的流出物。加600l Wash Buffer到Spin Column管中，离心30秒。重复步骤5。空管离心1分钟。将Spin Column管转移至新的灭菌的1.5mL离心管中。在膜的中央加Elution Buffer或不含RNase的去离子

5、水（PH7.0）20-50l，室温静止1分钟。再离心30秒。1.5mL离心管中的即为提取的总RNA。注意事项避免环境中RNase的污染，操作要带手套。所有枪头和EP管以DEPC水处理，移液枪保证洁净无RNase污染。如样本中加入溶液R2后，出现白色絮状、丝状沉淀，这是DNA析出，对RNA提取影响不大。避免的措施：降低细胞密度；加入溶液R2之前，充分振荡混匀悬液；加入溶液R2之后，稍等片刻再振荡混匀。样本上清液加入Spin Column管中离心30秒后，如Spin Column管中仍有液体，表明样本超量或裂解不完全导致吸附膜阻塞。处理方法：减少样本量；加入溶液R2后，充分振荡混匀。尽量保证在膜中