Takara 实验技能讲座之Western blot课件

1、蛋白相关产品介绍-Western Blot上海皓嘉科技发展有限公司什么是Western blot？2 免疫印迹（immuno blotting）又称蛋白质印迹（western blot），它是根据抗原抗体的特异性结合，检测复杂样品中的某种蛋白质的方法。western blot是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDS的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。用途：常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白的丰度进行定性和半定量分析。HRP标记的二抗HRP底物(Luminol)化学发光信号Western blot步骤3 样品制

2、备4 细胞裂解蛋白纯化蛋白定量细胞裂解5 xTractor Buffer635656xTractor Buffer Kit 635623 裂解细胞种类：Bacterial cells、Mammalian cellsYeast cells、Baculovirus-infected cellsYeast Protein Extraction Reagent9780酵母总蛋白质提取试剂简捷、快速的提取酵母菌总蛋白质的试剂蛋白酶抑制剂ProteoGuard EDTA-Free Protease Inhibitor Cocktail 635672Calpastatin7316细胞裂解液Calpain竞争

3、性抑制剂细胞裂解：比较常用超声波破碎法和酶溶破碎法。蛋白定量方法灵敏度时间原理干扰物质说明产品紫外吸收法20-100 mg/ml快速5-10分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280 nm处的光吸收各种嘌呤和嘧啶；各种核苷酸干扰物质较多Bradford法1-1000 g/ml快速5分钟考马斯染料与蛋白质结合后，溶液的颜色发生变化。这种颜色的变化与溶液中的蛋白质浓度成正比。表面活性剂：TritonX-100；SDS操作简便；可对含有还原剂的样品进行测定；颜色稳定；颜色深浅随不同蛋白质变化。TaKaRa Bradford Protein Assay Kit（T9310A）BCA法0.02-2 mg/

4、ml较快速30分钟内二价铜离子 (Cu+2) 在碱性条件下被蛋白质的肽键还原成一价铜离子 (Cu+) ，两个分子的BCA 络合一个一价铜离子 (Cu+) ，形成一种在562 nm处有强吸收值的紫色复合物。螯合剂、还原剂：EDTA、EGTA、-巯基乙醇不受蛋白质种类的影响；对表面活性剂的干扰影响小。TaKaRa BCA Protein Assay Kit（T9300A）7 8 相关产品方法名称Code包装量价格（元）特点BCA法TaKaRa BCA Protein Assay KitT9300A500 次700不受蛋白质种类的影响，在0.022 mg/ml浓度范围内蛋白质浓度与吸光度值成线性关系

5、；对表面活性剂的干扰影响小；2种操作方法（标准操作方法；低浓度测定操作方法）Bradford法TaKaRa Bradford Protein Assay KitT9310A500 次500操作简便，可快速地对浓度范围在11,000g/ml的蛋白质溶液进行定量。可对含有还原剂的样品进行测定；2种操作方法（标准操作方法；低浓度测定操作方法）8 电泳(SDS)10 蛋白分子量胶浓度 40 kDa 80 kDa 12.5%小于40 kDa 15%大于80 kDa 10% 凝胶的选择样品制备还原处理的样品和非还原处理的样品同时电泳分子量Marker的选择预染蛋白marker普通蛋白marker设立对照样

6、品设立比对样品空质粒对照样品、整个菌液、上清、沉淀对比样品与检测样品同时电泳SDS电泳中蛋白质分子所带的电荷差异对电泳的影响是微乎其微的，可以忽略不计。SDS电泳中白质的迁移速度与其分子量大小成反比，分子量越小，迁移速度越快。11 相关产品11 CLEARLY Stained Protein Ladder3454ACLEARLY Protein Ladder (Unstained)3453ATris-Glycine-SDS Buffer (TG-SDS) Powder, pH8.3T9101Tris-Glycine Buffer (TG) Powder, pH8.3T9102TaKaRa CB

7、B Protein Safe StainT9320A以CBB为主要成分制备的蛋白质高灵敏度染色液迅速（染色5分钟后可确认蛋白质片段）使用安全不含有害物质甲醇和乙酸可使用去离子水进行脱色2Protein SDS PAGE Loading Buffer91724Protein SDS PAGE Loading Buffer9173上样loading预染Marker与非预染Marker电泳缓冲液染色液12 电泳仪12 垂直电泳系列产品详情请见：/genepro/depshow.asp?id=1437双向电泳系列产品详情请见：/genepro/depshow.asp?id=1438转膜14 膜的选择常

8、用的转移膜主要有PVDF膜（Polyvinylidene-Fluoride）和硝酸纤维素膜。PVDF膜与目的蛋白的结合能力高，灵敏度高，不易破碎，同时也适用于再次标记(Reprobing)（为了增加PVD膜的亲水性，膜使用前需浸泡在甲醇中）。而硝酸纤维素膜虽不需要浸泡但极易破碎。膜标记好正反面转膜缓冲液Tris-Glycine Buffer (TG) Powder, pH8.3T9102转膜：蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移到膜上。15 转膜仪（转印仪）15 水平半干转印系列产品详情请见：/genepro/depshow.asp?id=1440转膜仪的选择分为半干转膜仪和湿电转膜仪。湿法转膜转

9、膜效率高且转膜均匀，但使用的电转液液量多，需边冷却边转膜，转膜时间长（过夜）。而半干转膜法转膜时间短，只需要少量的电转液。封闭封闭剂的选择 有时特定的封闭剂达不到预期的封闭效果。另外封闭时间过长会抑制抗原抗体反应及标记抗体的酶活性，应准备几种封闭剂进行点杂交预研讨实验选择合适的封闭剂。17 注意避免让膜变干封闭的作用：为了防止蛋白检测用抗体非特异性与膜结合，对未结合蛋白的膜区域进行封闭很重要。18 相关产品18 Western BLoT Blocking Buffer (Fish Gelatin)T7131AWestern BLoT Blocking Buffer (Protein Free）

10、T7132A在TBS-T Buffer含有鱼源明胶的封闭缓冲液。同哺乳动物来源的奶粉和BSA相比，不会与哺乳动物来源抗体出现非特异性交叉反应。可抑制背景，能够明确地检测出抗原。不含蛋白质（Protein Free）的化学成分封闭缓冲液。同一般的脱脂奶粉相比，可提高检测灵敏度。有效地用于检测磷酸化蛋白质。19 洗涤洗涤液的选择一般使用PBS或TBS缓冲液。根据目的蛋白和检测试剂选择洗涤液。选择不含抑制HRP的叠氮化钠的洗涤液比较好。磷酸化蛋白质适合使用TBS缓冲液或含Tween20的TBS缓冲液。19 Tris Buffered Saline with Tween20 (TBS-T) Table

11、ts, pH7.6T9142 ELISA、Western Blotting的清洗Buffer或封闭Buffer。 抗体稀释。Tris Buffered Saline (TBS) Tablets, pH7.6T9141 ELISA、Western Blotting、免疫组织染色用的清洗Buffer。 样品稀释。Phosphate Buffered Saline with Tween20 (PBS-T) Tablets, pH7.4T9183 ELISA、Western Blotting的清洗Buffer或封闭Buffer。 抗体稀释。Phosphate Buffered Saline (PBS)

12、 Tablets, pH7.4T9181 ELISA、Western Blotting、免疫组织染色用的清洗Buffer。 清洗细胞。 样品稀释。Western Blotting操作过程中需洗膜，洗膜可除去未反应的试剂，抑制背景。20 Western blot步骤20 一抗孵育二抗孵育一抗孵育一抗的选择抗体有识别1个抗原决定簇的单克隆抗体和识别多个抗原决定簇的多克隆抗体。另外有的抗体识别一级结构，有的抗体识别立体结构，后者不能与变性或还原的蛋白质结合。制备抗体时，如果免疫原是变性蛋白，那么制备的抗体只能与变性蛋白结合，不能与天然蛋白质结合。用于Western Blotting的一抗一般都有销售

13、。购买抗体时要考虑以上几点，选择抗体时，对同一个抗原的不同类型抗体在产品数据上进行详细调查后再购买，尽量使用特异性高的单克隆抗体。反应方法减少失败的最好方法是将高度稀释的低浓度抗体溶液添加到托盘中，放入膜后，4缓慢摇动过夜孵育。如果抗体使用量有限制，建议使用杂交袋，使用杂交袋时要确保不能有气泡。21 使用一抗进行目的蛋白的检测。抗体查询22 http:/www.takara-bio.co.jp/antibody_search/antibody_search.php抗体种类细胞间连接、钙粘着蛋白抗体细胞外基质关联骨代谢关联血小板关联信号传导关联等疾病相关抗体（IBL）His标签抗体Western

14、 blot 快速检出试剂（二抗替代物） - Western BLoT Rapid Detect v2.024 短时间内有效的进行抗体反应，可以使用Rapid操作方法提高检出感度，IgG Detector标记50个HRP分子增加信号强度。动物种HRP标记二抗替代物（检测Mouse IgG时需要使用Enhancer，不能替代goat IgG、human IgG3二抗）Western BLoT Rapid Detect v2.0T7122A50 次3170 元Western blot步骤25 检测化学发光检测相关产品化学发光27 产品名称Code包装量价格（元）检出灵敏度概要检测方法Western

15、BLoT Chemiluminescence HRP SubstrateT7101A250 ml1,600pg级其他公司同等产品发光强度比较X filmWestern BLoT Quant HRP SubstrateT7102A100 ml2,050低pg级发光持续而稳定CCD成像、X filmWestern BLoT Hyper HRP SubstrateT7103A100 ml2,500中fg级检出灵敏度的比较CCD成像、X filmWestern BLoT Ultra Sensitive HRP SubstrateT7104A100 ml4,130低fg级检出灵敏度和抗体用量CCD成像、

16、X film28 发光强度比较28 Western BLoT Chemiluminescent HRP Substrate（Code：T7101A）同其他公司同等HRP反应基质制品比较，利用HRP标记二抗（395,000 pg）进行slot blot检测发光信号。抗体：Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Peroxidase conjugated膜：nitrocellulose使用Western BLoT Chemiluminescent HRP Substrate可高灵敏度地检测出清晰的信号（曝光时间：5秒、X film。本公司数据） 明亮的发光信号29 发光持续而稳定29 稳

17、定发光持续时间长使用Western BLoT Quant HRP Substrate（制品Code： T7102A）利用slot blot方法可以确认发光的持续性sample：人Transferrin ，200 ng起始2倍梯度稀释一抗 ：Goat anti-Human Transferrin Affinity Purified 二抗 ：Affinity Purified Antibody -Anti-Goat IgG(H+L) Peroxidase labeled 从反应开始90min，发光还持续稳定，一次反应也可重复进行曝光检测。本公司数据30 检出灵敏度比较30 使用少量抗体，可进行高灵

18、敏度检出HeLa细胞裂解液梯度稀释后作为样品，改变抗体使用量，western blot检测出GAPDH。sample ： HeLa细胞裂解液总蛋白，从10 g起始2倍梯度稀释一抗： Anti-Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase, clone 6C5 （1 mg/ml） 二抗： Pierce Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Peroxidase conjugated （0.8 mg/ml） 使用Western BLoT Hyper Substrate（T7103A）更少的抗体量也可以检出本公司数据31 检出灵敏度和抗体使用量Hela

19、细胞裂解液梯度稀释的样品，SDS电泳后，根据制品的灵敏度调整抗体稀释倍数，Western blot检出GAPDH。31 Sample ： HeLa细胞裂解液总蛋白，从10 g起始2倍梯度稀释 一抗：Anti-Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase, clone 6C5（1mg/ml）（Merck Millipore） 二抗：Pierce Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Peroxidase conjugated （0.8 mg/ml） 使用Western BLoT Ultra Sensitive即使减少抗体使用量也可进行高灵敏度检测本

20、公司数据32 检测增强剂32 适用于包括Western印迹和ELISA在内的各种免疫检测可提高最终的检测灵敏度(从数倍到数十倍)不影响辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)活性兼容于交联二抗的酶和使用任何一种检测方法(如：比色检测法或发光检测法)检测Human Transferrin（各种抗体稀释液使用情况比较）1TBS-T2Western BLoT Immuno Booster（code：T7111A）3A社反応促進試薬4Western BLoT Immuno Booster PF（code：T7115A）抗体稀释：抗体稀释溶液情况如下： Immuno Booster本公司数据33 检

21、测系统33 生物发光检测 (冷光仪) 系统详情请见：/genepro/depshow.asp?id=1450洗膜重新标记34 Western进行了膜上的一抗及二抗的消除试剂相对温和的条件下（室温，30分）的反应Western BLoT Stripping Buffer T7135A1 HeLa Cell Lysate 10 g 2 HeLa Cell Lysate 5 g 3 HeLa Cell Lysate 2 g 4 HeLa Cell Lysate 1.25 g 5 HeLa Cell Lysate 0.625 g 1-actin検出（第一次抗原抗体反应）Stripping（条件 : 室

22、温、30分、0.25 ml/cm2 membrane ）2GAPDH検出（第二次抗原抗体反应）Stripping（条件 : 室温、30分、0.25 ml/cm2 membrane ）3-Tubulin検出（第三次抗原抗体反应）4残存抗体検出Stripping（条件 : 室温、30分、0.25 ml/cm2 membrane ）本公司数据35 常见技术问答有污渍或斑点，整体背景普遍偏高出现白色条带出现非特异性条带信号弱或无信号膜上部分无信号条带扩散35 36 洗膜不充分使用的膜有问题封闭不充分使用的封闭剂不适合封闭剂与一抗或二抗有交叉反应实验器具有污染缓冲液有污染曝光时间过长抗体浓度过高HRP标

23、记抗体发生凝集使用杂交袋进行抗体孵育时，杂交袋内有残留气泡转膜抗体封闭其他有污渍或斑点，整体背景普遍偏高37 20132015201401 抗原、抗体检测 0203 蛋白抗体量不充分标记抗体失活膜上的抗原分解发光底物孵育时间过短曝光时间过短发光底物劣化蛋白质转膜不成功目的蛋白质量较差蛋白制备过程中降解膜上保存的蛋白质分解目的蛋白blocking后被屏蔽洗膜、重新标记洗膜、重新标记信号弱或无信号Western BLoT Immuno Booster（code T7111A）Western BLoT Rapid Detect v2.0（code T7122A）其他常见问题38 膜上部分无信号转膜不完全出现白色条带抗体浓度过高出现非特异性条带抗体浓度过高SDS对蛋白质的非特异性吸附条带扩散抗体浓度过高电泳用的蛋白量过高其他问题相关产品方法名称Code包装量价格（元）特点BCA法TaKaRa BCA Protein Assay KitT9300A500 次700不受蛋白质种类的影响，在0.022 mg/ml浓度范围内蛋白质浓度与吸光度值成线性关系；对表面活性剂的干扰影响小；2种操作方法（标准操作方法；低浓度测定操作方法）Bradford法TaKaRa Bradford Protein Assay KitT9310A500 次500操作