核酸检测医学知识培训课件

1、核酸检测医学知识核酸检测医学知识为什么要做核酸检测？核酸检测医学知识2为什么要做核酸检测？核酸检测医学知识2 核酸检测（基因检测） 现知人类的疾病都与基因有直接或间接的关系。医学实验室所要检测和分析的核酸既包括人体本身的基因(DNA ) 以及反映基因转录水平的mRNA , 也包括侵入人体的致病微生物等所携带的外源性基因(DNA/RNA )。 核酸检测医学知识3 核酸检测（基因检测）核酸检测医学知识3传统检测试剂（酶免ELISA）技术特点： 检测目标为蛋白, 所检测的主要是疾病所引发的人体抗体而不是病原体本身,是一种间接、滞后的检测方式。易操作，成本低。 固有不足：不能够消除对“窗口期”标本(抗

2、体阴性,核酸阳性)的漏检难于检测病原体的不同亚型及突变型不典型血清阳转对免疫逃避或免疫沉寂的标本产生漏检核酸检测医学知识4传统检测试剂（酶免ELISA）技术特点：核酸检测医学知识4核酸检测显著缩短窗口期:HIV窗口期缩短45%，HCV缩 短89%，HBV缩短50%。提 高 灵 敏 度:理论上扩增体系中单拷贝的模板 也能被检测出。特 异 性 好:使用荧光探针技术的PCR检测， 几乎没有方法学的假阳性。直接揭示病原体的存在 对操作者及检测环境的要求较高检测成本相对较高核酸检测医学知识5核酸检测显著缩短窗口期:HIV窗口期缩短45%，HCV缩核酸输血中可传染病原体的“窗口期”病毒种类ELISA检测项

3、目窗口期HCV抗-HCV 2.0/3.0 EIA 8-10周HIV抗-HIV-1/2 EIA and HIV-1 抗原 EIA 2-4周HBVHBVsAg EIA and HBVcAg EIA 6-8周HTLV抗-HTLV I/II EIA 8-10周CMV抗-CMV EIA 3-5 周核酸检测医学知识6输血中可传染病原体的“窗口期”病毒种类ELISA检测项目窗口窗口期检测率国家或地区HBVHCVHIV加拿大1:153000(1/15万)1:2300000(1/230万)1:7800000(1/780万)法国1:640000(1/64万)1:10000000(1/1000万)1:3150000

4、(1/315万)德国1:230000(1/23万)1:670000(1/67万)1:2770000(1/277万)日本（50混）1:51988(1/5.2万)1:348091(1/35万)1:2668696(1/267万)美国（24混）1:180000(1/18万)1:230000(1/23万)12:37164054(1/309万)香港1:32786(1/3.3万)1:5456(1/0.5万)1:222(1/0.02万)核酸检测医学知识7窗口期检测率国家或地区HBVHCVHIV加拿大1:15300核酸检测在临床诊断中的应用定性诊断 血液筛查 病原体筛查诊断 SNP和耐药突变诊断 基因型分型 遗

5、传病诊断 个体用药诊断 基因鉴定和配型 定量检测 病情的评估和预后判断 抗病毒药物疗效的观察 新药验证 癌基因表达差异 核酸检测医学知识8核酸检测在临床诊断中的应用定性诊断定量检测核酸检测医学知识8核 酸 是 什 么？ 核酸检测医学知识9核 酸 是 什 么？ 核酸检测医学知识9核酸（Nucleic Acid）是一种主要位于细胞核内的生物大分子，其充当着生物体遗传信息的携带和传递。核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内。 现已发现近2000种遗传性疾病都和DNA结构有关。肿瘤的发生、病毒的感染、射线对机体的作用等都与核酸有关。 核酸检测医学知识10核酸（Nucleic Acid）是一种主要位

6、于细胞核内的生物核酸分类：DNA、RNA；DNA：dATP（A）、dTTP（T）、 dCTP（C）、dGTP（G）；RNA：ATP、UTP、CTP、GTP；35磷酸键核酸检测医学知识11核酸分类：DNA、RNA；核酸检测医学知识11DNA结构单链DNA形成双链的原则 碱基互补配对： G-C T-A外部为磷酸和戊糖形成的骨架内部为碱基互补形成的共价结合区域螺旋结构核酸检测医学知识12DNA结构单链DNA形成双链的原则外部为磷酸和戊糖形成核酸核酸在体内的复制核酸检测医学知识13核酸在体内的复制核酸检测医学知识13DNA的热变性DNA受热，会解开双链互补状态，形成单链；降温会恢复双链状态核酸检测医学

7、知识14DNA的热变性DNA受热，会解开双链互补状态，形成单链；降温怎样进行核酸检测？核酸检测医学知识15怎样进行核酸检测？核酸检测医学知识15核酸检测的一般流程核酸样品的制备： 从血液、体液、组织中提取或PCR扩增样品的检测： 核酸杂交、PCR、荧光定量PCR、PCR-ELISA等 结果判读： 电泳、膜、荧光定量PCR仪等核酸检测医学知识16核酸检测的一般流程核酸样品的制备：核酸检测医学知识16核 酸 杂 交 核酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。其原理是核酸变性和复性理论。即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双边结构。杂

8、交通常在一支持膜上进行，因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为DNA印迹交（Southern blot hybridization ）和RNA印迹杂交（Northern blot hybridization）。核酸检测医学知识17核 酸 杂 交 核酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小核酸提取PCR扩增探针点膜交联杂交显色结果判读核酸检测医学知识18核酸提取PCR扩增探针点膜交联杂交显色结果判读核酸检测医学知PCR聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。DNA的

9、复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 核酸检测医学知识19PCR聚合酶链式反应(Polymerase Chain RePCR的产生核酸检测医学知识20PCR的产生核酸检测医学知识20实时荧光PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行分析的方法,

10、可以进行定量和定性检测。核酸检测医学知识21实时荧光PCR 在PCR反应体系中加入核酸检测医学知识22核酸检测医学知识22核酸检测医学知识23核酸检测医学知识23核酸检测医学知识培训课件核酸检测医学知识25核酸检测医学知识25荧光定量PCR标记方法内掺式染料SYBR Green I序列特异性探针Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET)引物特异性探针 Amplifluor (Intergen)核酸检测医学知识26荧光定量PCR标记方法内掺式染料核酸检测医学知识26SYBRGREEN 双探针杂交分子信标 Taqman 引物特异探针 性质 可逆荧光 积累荧

11、光 熔点分析 能不能特异性 引物（非特异性扩增或引物二聚体有影响） 引物2探针 引物探针 引物探针 引物（非特异性扩增或引物二聚体有影响） 探针无有有有无通用性通用专用专用专用专用探针特点核酸检测医学知识27SYBR双探针分子Taqman 引物特异性质 可逆荧光 积SYBR Green 融解曲线分析核酸检测医学知识28SYBR Green 融解曲线分析核酸检测医学知识28SYBR Green法优缺点优点:对DNA模板没有选择性适用于任何DNA使用方便-不必设计复杂探针非常灵敏便宜核酸检测医学知识29SYBR Green法优缺点核酸检测医学知识29TaqMan探针法核酸检测医学知识30TaqMa

12、n探针法核酸检测医学知识30TaqMan法优缺点核酸检测医学知识31TaqMan法优缺点核酸检测医学知识31核酸检测医学知识32核酸检测医学知识32市 场 状 况核酸检测医学知识33市 场 状 况核酸检测医学知识33生产厂家检测项目使用技术使用仪器达安基因HBV、HIV、HCV、HPV 、TB、HCMV、淋球菌、解脲脲原体、肺炎支原体、沙眼衣原体、单纯疱疹病毒型、地中海贫血、缺失型-地中海贫血、淋球菌、血筛试剂PCR荧光探针法PCR-反向点杂交法荧光定量PCR仪PCR仪上海科华HBV、HCV、新型冠状病毒、血筛试剂PCR荧光探针法PCR-酶免荧光定量PCR仪酶免相关仪器匹基HBV、HIV、HP

13、V、TB、HCV、沙眼衣原体、新型冠状病毒PCR荧光探针法荧光定量PCR仪上海华美HBV、HCV、TB、沙眼衣原体、新型冠状病毒PCR荧光探针法荧光定量PCR仪上海克隆HBV、TB、HPVPCR荧光探针法荧光定量PCR仪凯普、港龙以HPV检测为主。浩源血筛试剂已进入审批阶段。罗氏、生物梅里埃公司有HIV检测试剂盒，均以各自公司的专利技术为主研发。核酸检测医学知识34生产厂家检测项目使用技术使用仪器达安基因HBV、HIV、HC现状和趋势1、现状：公司多、竞争激烈、同质化；手工操作为主；缺乏规范；核心技术少；2、趋势：管理部门逐渐加强管理，相关标准制订中；进口试剂以全自动诊断平台为主在国内推广，国内厂家渐进推出自动化核酸提取仪器进入市场；核酸检测医学知识35现状和趋势1、现状：公司多、竞争激烈、同质化；手工操作为主；实时荧光PCR检测的难点1、大规模适合自动化核酸提取的样品制备技术2、适合筛查应用的多重PCR技术3、高通量全自动的核