细胞第三章课件

1、第三章 细胞生物学研究方法Figure 3-1. Resolving power. Sizes of cells and their components drawn on a logarithmic scale, indicating the range of objects that can be readily resolved by the naked eye and in the light and electron microscopes. The following units of length are commonly employed in microscopy: m (m

2、icrometer) = 10-6 m nm (nanometer) = 10-9 m (ngstrm unit) = 10-10 m A. Resolution and magnification第一节 细胞形态结构的观察方法一、光学显微镜技术1、普通复式光学显微镜技术 普通光学显微镜（最大分辨率为0.2m），主要由三部分组成：光学放大系统，即目镜和物镜；照 明系统；机械和支架系统。 显微镜的性能优劣决定于它的分辨率。分辨率是指显微镜区分开相近两点的能力。 为光源波长，为物镜镜口角 。 D=061N sin/2 2、荧光显微镜技术 在紫外光显微镜基础上发展而来，利用样品自发荧光和诱发荧光，可

3、以对某些生物大分子进行定性和 定位研究。不仅可以观察固定切片标本，还可以在活体染色后对活细胞进行研究。 3、激光共焦点扫描显微镜 技术 共焦点是 指物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点。它 在某一瞬间只用一束通过检测器前的小孔的光成像，可显著提高分辨率。可以观察较厚样品的内部结构。5Figure 3-5. Making tissue sections. How an embedded tissue is sectioned with a microtome in preparation for examination in the light microscope. B. Preparation o

4、f specimen取材固定脱水包埋切片脱蜡复水染色脱水透明封片观察Figure 3-4. Edge effects. The interference effects observed at high magnification when light passes the edges of a solid object placed between the light source and the observer. 4、相差显微镜技术和微分干涉显微镜技术 光线在通过密度不同的介质时，其滞留程度不同，即产生了光程差和相位差。相差显微镜 的基本原理把光程差变成振幅差(即明暗)。从而提高样品反差

5、，故样品不需染色，适合观察活细胞。甚至研究细胞核、线粒体等细胞器的动态。它在结构上与普通显微镜最大的不同是在物镜后装有相差板。 微分干涉显微镜用的是偏振光，增加了样品反差，并具有立体感，可作于研究活体细胞中较大的细胞器。 录像增差显微镜技术在一定程度上可以填补光镜与电镜之间分辨率上的间隙。 12RAW264.7细胞在37、5CO2条件下，用含10小牛血清、青霉素(1 X10 UL)及链霉素(100m L)的DMEM培养液培养。液氮中复苏 换液 传代对数生长期传板冻存保留细胞 Figure 3-6. Four types of light microscopy. (A) The image of

6、 a fibroblast in culture obtained by the simple transmission of light through the cell, a technique known as bright-field microscopy. The other images were obtained by techniques discussed in the text: (B) phase-contrast microscopy, (C) Nomarski differential-interference-contrast microscopy, and (D)

7、 dark-field microscopy. Figure 3-7. The confocal microscope. This diagram shows that the basic arrangement of optical components is similar to that of the standard fluorescence microscope except that a laser is used to illuminate a small pinhole whose image is focused at a single point in the specim

8、en (A). Fluorescence from this focal point in the specimen is focused at a second pinhole (B). Light from elsewhere in the specimen is not focused here and therefore does not contribute to the final image (C). By scanning the beam of light across the specimen, a very sharp two-dimensional image of t

9、he exact plane of focus is built up that is not significantly degraded by light from other regions of the specimen. F. The confocal microscopeGFP can be used to study dynamic processes as they occur in a living cell.（一）电了显微镜基本知识 分辨率最终决定于光的波长，由于使用电子束作光源，电镜的分辨率大大提高。电镜的分辨率常常是超薄切片厚度的1/10，它的分辨率可达0.2nm，其放

10、大倍数为106倍。 电镜的基本构造包括：电子束照明系统 ；电磁透镜成像系统；真空系统；记录系统；电源系统。（P52表3-1）（二）主要电镜制样技术介绍人 样品制备技术的特殊要求：样品要薄；更好地保持样品的精细结构；样品具有一定的反差。 18 主要的用于观察生物样品的电镜技术有：超薄切片技术；是观察细胞超微结构的基础。负染色技术；冷冻断裂和冷冻蚀刻电镜技术技术； 电镜三维重构技术；扫描电镜技术（SEM）是观察细胞表面形的有力工具。三、扫描隧道显微镜(STM) 是一种探测微观世界物质表面形貌的仪器，在纳米生物学的研究领域具有独特的优越性。 STM的特点：具有原子尺度的高分辨本领；可在真空、大气、液

11、体等条件下工作；非破坏性测量。 20Chemical fixationSpecimen Preparation for Electron MicroscopyThin Sectioning for TEMThe wax sections: 3-10um;The Plastic ultrathin-sections for TEM: 40-50nmSections of LM: 5um;Sections of TEM: 100nm Figure 3-9. Electron micrograph of a root-tip cell stained with osmium and other he

12、avy metal ions. The cell wall, nucleus, vacuoles, mitochondria, endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, and ribosomes are easily seen. Figure 3-10. Scanning electron microscopy. Scanning electron micrograph of the stereocilia projecting from a hair cell in the inner ear of a bullfrog (A). For compar

13、ison, the same structure is shown by differential-interference-contrast light microscopy (B) and by thin-section electron microscopy (C). Figure 3-11. Cells in culture. Scanning electron micrograph of rat fibroblasts growing on the plastic surface of a tissue-culture dish.Figure 3-13. Preparation of

14、 a metal-shadowed replica of the surface of a specimen. Note that the thickness of the metal reflects the surface contours of the original specimen. Figure 3-14. Freeze-fracture electron micrograph of the thylakoid membranes from the chloroplast of a plant cell. These membranes, which carry out phot

15、osynthesis, are stacked up in multiple layers. The largest particles seen in the membrane are the complete photosystem II-a complex of multiple proteins. IV. Freeze-Fracture and Freeze-Etch Electron Microscopy Figure 3-15. Freeze-etch electron microscopy. The specimen is rapidly frozen, and the bloc

16、k of ice is fractured with a knife (A). The ice level is then lowered by sublimation in a vacuum, exposing structures in the cell that were near the fracture plane (B). Following these steps, a replica of the still frozen surface is prepared, and this is examined in a transmission electron microscop

17、e. Freeze Fracture Replication and Freeze Etchingquick freeze deep etching第二节 细胞组分的分析方法细胞成分分析和形态学观察相结合，可揭示生物大分子在细胞内的构建及功能。一、用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物 利用多种方法使细胞崩解，形成细胞器和细胞组分的混合匀浆，再通过差速离心，即利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。 差速离心与密度离心相结合可以达到精确的分离。A. The technique of differential centrifugationStep-by-st

18、ep procedure for the purification of organelles by differential centrifugation.S=(dx/dt)/2x =110-13sec. Figure 3-16. The preparative ultracentrifuge. Figure 3-17. Cell fractionation by centrifugation. Repeated centrifugation at progressively higher speeds will fractionate homogenates of cells into t

19、heir components. In general, the smaller the subcellular component, the greater is the centrifugal force required to sediment it. Typical values for the various centrifugation steps referred to in the figure arelow speed: 1,000 times gravity for 10 minutes medium speed: 20,000 times gravity for 20 m

20、inutes high speed: 80,000 times gravity for 1 hour very high speed: 150,000 times gravity for 3 hours 34Figure 3-18. Comparison of methods of velocity sedimentation and equilibrium sedimentation. 细胞不同组分沉降率不同，主要依赖于它们的形状和大小，通常以沉降系数S来表示(沉降系数是指悬浮在密度较低的溶剂中的一种溶质大分子，在每单位离 心场作用下的沉降速率)。二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类、脂质等到的

21、显色方法 原位成分分析常利用一些显色剂与所检物质的特殊基团特异性结合的特征，通过染色反应的部位和颜色的深浅来断某种物质在细胞内的分布与含量。 福尔根(Feulgen)反应可特异显示DNA的存在部位。 PAS反应可确定多糖的存在。 四氧化锇 可证明脂肪滴的存在。苏 丹 和苏丹 黑也常用于脂肪的鉴定。 米伦反应及重氮反应等用来测定蛋白质。 检测和定位酶的技术是基于细胞或组织切片与适宜底物共同孵育，通过一定方法使产物显示出来 。例如检测碱性磷酸酶的格莫瑞方法。三、特异蛋白质抗原的定位与定性 免疫荧光和免疫电镜是最常用的细胞内蛋白质定位技术。1、免疫荧光技术 免疫荧光技术就是将免疫学方法与荧光标记技术

22、 相结合研究特异蛋白质抗原在细胞内分布的方法。Figure 3-19. Indirect immunocytochemistry. The method is very sensitive because the primary antibody is itself recognized by many molecules of the secondary antibody. The secondary antibody is covalently coupled to a marker molecule that makes it readily detectable. Commonly u

23、sed marker molecules include fluorescein or rhodamine dyes, the enzyme horseradish peroxidase or colloidal gold spheres, and the enzymes alkaline phosphatase or peroxidase. 2、免疫电镜技术 免疫电镜技术使特异蛋白的定位与超 微结构结合起来，使抗原定位更准确。如蛋白分泌的研究胞内酶 的研究；一些结构蛋白的研究。 四、细胞内特异核酸的定位与定性1、原位杂交技术 用标记的核酸探针通过分子杂交确定特殊核苷酸序列在染色体上或细胞中的

24、位置的方法。2、Southern技术（了解） 蛋白样品经电泳后，与DNA探针进行吸附，与DNA有亲合作用的蛋白带被显示出来。 五、利用放射性标记技术 研究生物大分子在细胞内的合成动态 放射自显影技术是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶的感光作用，对样品中放射性标记物进行定性与定位测定。 放射自显影技术包括两个主要步骤：即同位素标记的大分子前体的掺入和细胞内同位素所在位置的显示。 基本步骤为：掺入、制片、敷胶、曝光、显影、镜检。 六、定量细胞化学分析技术1、显微分光光度测定技术 根据细胞内某些物质对光谱吸收的原理，来测定这些物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。2、流式细胞仪 可定量地测定某一细

25、胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量。第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术一、细胞培养 细胞培养就是将动植物组织或细胞从机体取出，分散成单个细胞 或直接以单细胞 生物，给予必要的生长条件，让其在培养瓶中或培养基上继续生长与增殖。（一）动物细胞培养 从机体取出立即培养的细胞叫原代细胞。适应在培养条件下持续传代培养的细胞为传代细胞。 通过纯系化或选 择法从原代培养细胞中分离出来的细胞群体叫细胞株，细胞分裂周期约限于5060次。 43从原代细胞或细胞株中获得的可无限传代的细胞叫细胞系。（二）植物细胞培养 单倍体细胞培养。 原生质体培养：去壁的植物细

26、胞叫原生质体。可培养成植株或体细胞杂交植株。（三）非细胞体系在细胞生物学研究中的作用 来源于细胞，而不具有完整的细胞结构，但包含了正常生物学反应所需的物质（供能系统和酶反应体系等）组成的体系即为非细胞体系。二、细胞工程 应用细胞生物学方法，按照预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传物质的技术以及发展这种技术 的领域为细胞工程。 细胞工程所使用的技术主要是细胞培养、细胞分化的定向诱导、细胞融合和显微注射等。（一）细胞融合与细胞杂交技术 真核生物的体细胞经过培养，两个或多个细胞融 合成一个双核 或多核细胞的过程叫细胞融合。 动物细胞融合一般要用灭活的病毒(如仙台病毒)或 化学物质(如聚乙二醇，即P

27、EG）介导；植物细胞事例时，要用纤维素酶去掉纤维素壁。 20世纪80年代又发明了电融合技术。 细胞融合可以在基因型相同的细胞间进行，也可以在基因型不同的种内细胞间甚至种间细胞间进行。（二）单克隆抗体技术 1975年英国学者Milestein等开创了将产生抗体的单 个细胞同瘤细胞杂交的技术。他们的设计是经绵羊红 细胞免过的小鼠脾细胞(B淋巴细胞)与骨髓瘤细胞融合，融合的杂交瘤具有两种亲本细胞的特性即可分泌抗绵 羊红细胞的抗体，又可无限增殖。学者们纷纷利用这 一技术来制备针对不同抗原的高度纯一的单克隆抗体。 单克隆抗体就是单个杂交瘤细胞 增殖产生的克隆细胞群分泌的高度纯一的抗体。（三）细胞折合与显

28、微操作技术 细胞拆合就是把细胞核与质分离开后将不同来源的细胞质与细胞核相互配合，形成核质杂交细胞。 显微操作技术：即在显微镜下用显微操作装置对细胞进行解剖和微量注射的技术。Figure 3-33. The production of hybrid cells. Human cells and mouse cells are fused to produce heterocaryons, which eventually form hybrid cells. These particular hybrid cells are useful for mapping human genes on specific human chromosomes because most of the human chromosomes are quickly lost in a random manner, leaving clones that retain only one or a few. The hybrid cells produced by fusing other types of