绪论医学细胞生物学教学课件

1、1延边大学医学院细胞生物学与医学遗传学教研室张子波11延边大学医学院12教 材：医学细胞生物学 主 编：杨康鹃 郑立红出版 社：人民军医出版社 22教 材：医学细胞生物学 23参考书：1.医学细胞生物学 主 编：胡以平 出版社：高等教育出版社，20092.医学细胞与分子学基础 主 编：陈仁彪 出版社：上海科学出版社，200333参考书：3第1章 绪 论4第1章 绪 论45细胞生物学(cell biology)： 从细胞水平（整体、亚微结构、分子）探讨生命活动规律的科学。第一节 细胞生物学研究内容、发展及其分科医学细胞生物学(medical cell biology)： 运用细胞生物学的理论和方

2、法，研究人体的细胞的形态结构和功能等生命活动规律和人类疾病发生、发展及其防治的科学。55细胞生物学(cell biology)：第一节 细胞生物6对象：细胞（cell，生命活动的基本单位）构成生物有机体代谢与功能生物有机体生长发育遗传（遗传全能性）细胞是基本单位一、细胞生物学研究的内容66对象：细胞（cell，生命活动的基本单位）构成生物有机体细研究水平： 细胞整体、亚微结构、分子水平利用光镜描述细胞的结构利用电镜或扫描探针探清细胞的亚微或分子结构 形态方面研究任务：7研究水平：利用光镜描述细胞的结构 形态方面研究任务：78化学组成新陈代谢规律相互关系和相互作用生命活动的基本规律人类疾病产生机

3、制防治疾病的方法和技术功能方面88化学组成功能方面891.组织工程：又称“再生医学”，指利用生物活性物 质，通过体外培养或构建的方法，再造 或修复器官及组织的技术。 可再造：骨、软骨、皮肤、肾、肝、消化道、角膜、 肌肉、乳腺2.干细胞(stem cell)：是来源于胚胎、胎儿或成体内 具有在一定条件下无限制自我更新与增殖分化能力的 一类细胞，能够产生表现型与基因型和自己完全相同 的子细胞，也能产生组成机体组织、器官的已特化的 细胞，同时还能分化为祖细胞。991.组织工程：又称“再生医学”，指利用生物活性物93.治疗性复制人类胚胎（治疗性人类克隆胚胎）： 利用成年人的皮肤细胞制造胚胎材料，移植入

4、 人体，代替人体的损坏或患病部分。治疗：糖尿病、帕金森病、阿尔茨海默病(老年痴呆症）2004年8月11日英国人类受精和胚胎技术管理局给英国纽卡斯尔大学的研究人员发放了“治疗性复制人类胚胎”的执照成为欧洲首家允许治疗性复制人类胚胎的国家。4.生物制药与医用生物学产品：应用生物体活细胞 产生从简单分子到复杂蛋白质等一系列生物制 药与医用生物学产品。 例如：干扰素、白介素、胰岛素等103.治疗性复制人类胚胎（治疗性人类克隆胚胎）：1011二、细胞生物学的发展历史(一)细胞的发现和细胞学说的创立(四)分子生物学的发展(二)经典细胞学的发展(三)实验细胞学的发展1111二、细胞生物学的发展历史(一)细胞

5、的发现和细胞学说的创立12细胞学说细胞学说（cell theory） ：细胞是一切生物体构造和功能上的基本单位，整个机体是由细胞和细胞的产物所组成。1212细胞学说细胞学说（cell theory） ：细胞是一切1313131314 Watson J D Crick FHC DNA双螺旋结构A-TG-CC-GA-TT-AC-G1414 Watson J D5 Phe苯丙Leu亮Iso异亮起始密码甲硫氨酸Val缬Ser丝Pro脯cThr苏Ala丙Arg精Tyr酪His组Glu谷氨酰氨终止密码终止密码Try色Cys半光Ser丝Arg精Asp天冬酰氨Lys赖Asp天冬氨酸G

6、lu谷Gly甘 密码子的中英文缩写对照表16163 5 Phe苯丙Leu亮Iso异亮起始密码1717171718基因突变的表型效应镰状细胞性贫血（AR）产生机制：珠蛋白基因第一外显子第6密码子突变异常血红蛋白分子（HbS）GAG GTG 谷氨酸 缬氨酸正常血红蛋白分子（HbA）1818基因突变的表型效应异常血红蛋白分子（HbS）GAG 19基因诊断：PCR-RFLP诊断镰状细胞贫血父母患儿正常儿胎儿13kb7.6kb5.4kb基因型 HbAHbS HbSHbS HbAHbA ?HbSHbS1919基因诊断：PCR-RFLP诊断镰状细胞贫血父母患儿正常儿2020202021线粒体乳腺细胞核未受精

7、卵细胞去核卵细胞细胞融合培养妊娠148天2121线粒体乳腺细胞核未受精卵细胞去核细胞融合培养妊娠148天22三、细胞生物学的主要分支学科 细胞形态学（形态和功能） 细胞化学（化学成分定位、分布及生理功能） 细胞生理学（生命活动规律） 细胞遗传学（染色体的结构功能） 分子细胞学（基因组的结构和功能） 细胞社会学（细胞识别、通讯及相互作用）2222三、细胞生物学的主要分支学科 细胞形态学（形态和功能）223一、细胞形态结构研究技术 （一）细胞显微结构研究的技术与方法第二节 细胞生物学研究方法概述光学放大系统照明系统机械和支架系统显微结构2323一、细胞形态结构研究技术 （一24尼康E-600显微镜

8、1.复式显微镜 ： 单筒目镜、双瞳目镜 最常用2424尼康E-600显微镜1.复式显微镜 ：242.暗视野显微镜： 利用被检物所反射或衍射的光线来观察标本 观察细菌、原生动物或提纯的细胞器等颗粒物质。252.暗视野显微镜：2526 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。3.荧光显微镜尼康E800荧光DIC显微镜 2626 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧27线粒体干细胞皮肤微管2727线粒体干细胞皮肤微管274.相差显微镜：

9、 利用光线通过不同物质所形成的反差来观察标本观察活细胞的细微结构和变化。284.相差显微镜：28链球菌形态29链球菌形态2930莱卡倒置显微镜 组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。5.倒置显微镜3030莱卡倒置显微镜 组成和普通显微镜一样，只不过物镜与316.共聚焦显微镜 无法用眼睛直接观察，只能用探测器收集每个像素点的信号，再通过软件重构图像。 分辨率比普通显微镜有少量提高。31316.共聚焦显微镜 无法用眼睛直接观察，只能用探测器32 电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样，所不同的是前者用电子束作光源，

10、用电磁场作透镜。另外，由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。这种切片需要用超薄切片机制作。电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍，由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。（二）细胞超微结构研究的技术与方法常用电子显微镜和X射线衍射仪。3232 电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样，所不同33JEM-1011透射电子显微镜 在光学显微镜下无法看清小于0.2m的细微结构，这些结构称为亚显微结构或超微结构。要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。1932年Ruska发明了以电子束为光源的透射电子显

11、微镜，电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。目前TEM的分辨力可达0.2nm。1.透射电子显微镜3333JEM-1011透射电子显微镜 在光学显微镜下无内质网透射电镜图34内质网透射电镜图3435 于20世纪60年代问世，用来观察标本的表面结构。其工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为

12、立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。 2.扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）3535 于20世纪60年代问世，用来观察标本的表面结构。36JEOL扫描电子显微镜3636JEOL扫描电子显微镜36人类血细胞SEM照片37人类血细胞SEM照片37（1）组织分离法（2）细胞培养法（3）超薄切片法（4）悬滴-复染法与喷镀法（5）冷冻蚀刻复型法（6）放射性核素电竞自显影技术3.电镜样品的制备38（1）组织分离法3.电镜样品的制备38二、细胞培养及相

13、关技术（一）体外细胞培养技术（二）细胞融合技术（三）细胞显微操作技术39二、细胞培养及相关技术（一）体外细胞培养技术（二）细胞融合技40三、细胞及亚细胞组分的分离和纯化技术 （一）细胞化学免疫荧光技术细胞化学: 在保持细胞结构的基础上，利用某些化学物质可与细胞内某些成分发生化学反应，在局部形成有色沉淀物的原理，以示待查物质存在于细胞中的部位。例如：Feulgen法显示DNA4040三、细胞及亚细胞组分的分离和纯化技术 41免疫细胞化学（immunocytochemistry）: 根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。抗原：大分子或与大分子相结合的小分子。抗体：由

14、浆细胞针对特定的抗原分泌的球蛋白。 如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。4141免疫细胞化学（immunocytochemistry）:42（二）细胞显微分光光度测定技术 根据细胞内某些物质对光谱吸收的原理，用以测定这些物质如核酸和蛋白质等生物大分子在细胞内的含量。吸收光谱的波长： 230 700nmFeulgen染色后的DNA吸收的波长：546nm细胞显微分光光度测定技术：定位和定量4242（二）细胞显微分光光度测定技术4243（三）流式细胞计量术（FCM） 用氩离子激光发出的激光束为激发光，通过调节液压，迫使悬浮的细胞排成单列

15、，按重力方向流动，当细胞通过激光束检测区时，细胞被激光束照射而向各个方向发出散射光，若经荧光染色的细胞，就会发出一定强度的荧光，仪器的检测系统，就可逐个对细胞的散射光和荧光强度进行测定，并将光信号转变成电信号，由电子控制台放大和显示。4343（三）流式细胞计量术（FCM）4344测量速度：5 000个细胞/s 8个相关参数分选出细胞纯度：9099%检测的参数：细胞大小、体积、DNA、RNA、总蛋白含量、表面抗原、受体、染色体等应用：细胞动力学、免疫学、体细胞学、肿瘤的诊断和治疗等。流式细胞仪特点4444测量速度：5 000个细胞/s 8个相关参数流式细胞仪4545454546464646474

16、7474748（四）放射自显影术（五）细胞器的分离与提纯技术4848（四）放射自显影术4849四、细胞分子生物学技术（一）细胞原位分子杂交技术分子杂交的基本原理：碱基的互补配对原位杂交（in situ hybridization）： 将细胞或组织切片固定在载玻片上，保持细胞中的 DNA和RNA在原位置条件下，与标记的 DNA或RNA分子探针进行原位杂交，通过放射性自显影或显微镜可探测到待查材料中被杂交的分子。直接进行基因定位、定量分析。4949四、细胞分子生物学技术分子杂交的基本原理：碱基的互补配对50原位杂交的特点:杂交在显微镜载玻片上中期染色体标本上进行。所谓原位即指标本上DNA原位变性，

17、在利用放射性或非放射性标记的已知核酸探针杂交后，通过放射自显影或非放射性检测体系来检测染色体上特异DNA或RNA顺序，可用放射性颗粒在某条染色体的区带出现的最高频率或荧光的强弱来确定探针的位置，从而进行准确的基因定位。原位杂交必须在已知探针的情况下方可进行，而在未知致病基因时，则无法进行基因定位。5050原位杂交的特点:杂交在显微镜载玻片上中期染色体标本上进行51荧光原位杂交（florescence in situ hybridization, FISH） 是一种非放射性原位杂交方法。用特殊荧光素标记核酸（DNA）探针，可在染色体、细胞和组织切片标本上进行DNA杂交，对检测细胞内DNA或RNA

18、的特定序列存在与否最为有效。探针不是放射性的而是将荧光染料与抗体蛋白结合进行检测。它们具有高度亲和力，有与放射性探针相同或更高的分辩率。5151荧光原位杂交5152固定生物样本并准备显微镜涂片预先调节显微镜标记探针对目标DNA进行变性进行原位杂交和杂交后洗涤免疫细胞化学染色显微镜观察荧光原位杂交（FISH）实验程序（是一种多步骤的实验方法）5252荧光原位杂交（FISH）实验程序5253现已可用不同的荧光染料同时进行多重原位杂交，显示出不同的荧光色泽。这种多色FISH技术近年来发展迅速，已成为基因定位作图和医学诊断的重要手段。1992年运用这种策略已能在中期染色体和间期细胞同时检测7个探针。科

19、学家们的目标是实现24种不同颜色来观察22条常染色体和X、Y染色体。5353现已可用不同的荧光染料同时进行多重原位杂交，显示出不同的54912t(9q/12q)t(9p/12p)利用FISH技术检测染色体易位5454912t(9q/12q)t(9p/12p)利用FISH技5555555556DNA探针技术1.是以已知DNA片段作为探针与待测样品DNA或其片段进行核酸分子杂交，判断二者同源性程度。2.根据杂交结果就可以分析待测DNA中有无该基因或该基因是否发生了变化，从而作出诊断。3.DNA探针（基因探针）是一段与目的基因相互补的核酸序列（DNA或RNA），其长度不一，可为完整基因亦可为其一部分

20、。4.探针：单链，带有容易被追踪和检测出来的标记。5.寡核苷酸探针：单碱基改变的检测。5656DNA探针技术5657目前可孕前诊断的单基因病 Prader-Willi综合征(PWS)、性畸形(SRY基因诊断)、X染色体连锁鱼鳞病、Duchenne肌营养不良（DMD）、脆性X染色体综合症、地中海贫血、地中海贫血、脊髓性肌萎缩、肯尼迪氏综合征及雄激素受体基因异常所致疾病、型粘多糖贮积症、Marfan综合征、血友病、视网膜母细胞瘤、无精子症相关基因缺失诊断、成骨发育不全、Huntington舞蹈症、Kallmann综合征、遗传性视神经萎缩、软骨发育不全、苯丙酮尿症、Wilson氏病、结节性硬化症等。

21、5757目前可孕前诊断的单基因病 5758聚合酶链反应（PCR）： 利用耐热的DNA聚合酶,以一对与模板DNA互补的寡核苷酸为引物，在体外模拟体内的DNA复制过程，即进行变性、退火和延伸三个阶段（循环30次），使目的DNA扩增到约106个拷贝，既100百万倍。优点：快速、简便、准确、可靠、经济、特异性强等。 扩增倍数=2n（ n：扩增周期）PCR模板DNA取材：细胞、发根、精斑、血斑、已制备成的标本、木乃伊（二）聚合酶链反应技术5858聚合酶链反应（PCR）： （二）聚合酶链反应技术5859引物：能与模板DNA两条链上的各一段序列互补的寡核苷酸（1520bp）上游序列： 5TTTGGAGGCAAGCAAGCA G 3PGC-1基因引物序列：扩增的DNA片段长度：508bp5TATTTAGGGTTTTGCCA