w3章人类基因组学课件

1、1 第三章 人类基因组学(human genomics)概述: 第一节 人类基因组和基因组学基因组(genome):一个生命体遗传信息的总和(单倍体细胞内)人类基因组(括:核基因组和mt基因组。通常指)基因组学(genomics):在整个基因组的层次上总体研究某一物种的所有基因的结构与功能,以及所有物种细胞的基因组在结构、功能上的异同关系。 结构基因组学：数量 位置距离 序列基因组学 功能基因组学：表达 调控 功能 比较基因组学：比较不同物种基因组的异同2第二节 人类基因组计划（ human genome project，HGP)20世纪90年代重大科学项目三大计划一、计划的提出及任务1986

2、 Renato Dulbecco1990.10 美国启动该计划 30亿美元 15年最初目标：1）构建人类基因组遗传图和物理图。2）确定人DNA全部核苷酸序列。3）定位全部基因。4）对其他生物进行类似研究。93年，增人类基因组的鉴定和分离。98年，增基因组多样性、强化功能基因组的研究。后基因组 生物系统学3二、参与研究者美、英、日、法、德、中、私人企业、研究公司、制药集团。三、研究状况2000年.6.23，6国科学家公布：人类基因组序列“工作框架图”（working draft）（90%），引起强烈反响。2001.2.12,国际人类基因组组织（6国）和Celera公司分别在Nature和 Sci

3、ence公布人类基因组序列工作草图（99%）。32亿bp 3千部红楼梦我国科学家 3p测序2004.10，公布人类基因组完成图。4四、HGP的意义理论意义：测序 基因数 基因功能医学意义：提供一个可资借鉴的正常人类基因信息库 先知先觉产前基因诊断.治疗药学意义附:我国水稻基因组研究2002,4,4, 中科院 Science 绘制完成水稻基因组序列总数：46022-55615 打破“生命越高级，基因数越多”的误区。5五、基因组作图和DNA测序概述 HGP任务：构建遗传图、物理图、确定DNA序列、定位基因基因组作图（genome mapping）：将基因组这一巨大研究对象分解成较易操作的小的结构区

4、域，分析研究。（一）遗传图（genetic map）或连锁图（lingkage map） 将每条染色体上的基因或遗传标记的相对位置经连锁分析确定下来构成的图。 经计算连锁的遗传标志间的重组率，确定基因的相对距离，用厘摩表示（centrimorgan，cM）， 1厘摩（cM）=减数分裂时两个基因间重组率为1%。例：A和B间的重组率为2连锁图ABC2357第三代遗传标志：即单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP） （1996） SNP定义：基因组中某一碱基的变异，频率大于1%。数量多（300多万），覆盖密度高。作用：用于遗传作图；多样性研究；识别、定位

5、疾病相关基因。8（二）物理图（physical map） 即确定各遗传标志之间的物理距离的图谱，以碱基对数量表示（bp，kb，mb（兆碱基）。物理图含两方面含义：其一：指以一段已知核苷酸序列的DNA片段（即称为序列标签部位，sequence tagged site,STS）为“位标”，以Mb或Kb作为图距的g图.例：对STS的要求：（1）在g组中有明确的位置（2）一段已知的序列，可用PCR扩增的单拷贝序列位标A位标B位标C3kb2Mb10 构建物理图时，先用限制酶将染色体DNA切成一个个片段，将之插入载体进行克隆化。这些载体包括：（1）酵母人工CS（yeast artificial chrom

6、osome,YAC）插入片段长度：0.52个Mp大片段.（2）细菌人工CS（bacterial artificial chromosome,BAC）插入片段:80300kb（3）P1噬菌体（bacteriophage P1）插入片段,最大125kb.（4） P1来源的人工CS（P1-deriverd,PAC）插入片段,300kb多用BAC构建克隆，然后对BAC克隆逐一测序。将随机长度的DNA片断在染色体上的排列顺序确定下来。这些克隆DNA片断连接起来，形成重叠克隆群（Conting），再将一个个（Conting)相连成线状，覆盖整个染色体。11（三）序列图（sequence map) 经对基因

7、组进行序列分析所建的图。亦指对g组的大规模测序。32亿bp。1、 g组DNA大规模测序（DNA测序的策略）（1）基于BAC连续克隆系的测序概括：在构建好BAC连续克隆系后（确定每一BAC所对应CS的区域）,对BAC逐一测序.步骤：1) 将待测BAC克隆随机切成小片段（约1.52kb）2) 将小片段克隆入测序载体3)对小片段DNA进行810倍左右覆盖率的测序4) 将相互重叠的读出序列（reads）组装成连续的重叠线。5) 从质量最高的读出序列中取得序列。6) 利用引物延伸或其他方法对BAC克隆中还存在的缝隙（gap）进行填补(gap filling)12（2）全g组的“鸟枪法”测序此策略不需要先

8、构建YAC、BAC重叠群 直接将g组DNA分解成2kb左右的小片段进行随机测序，再用计算机进行策略组装。 例Celera公司测序自动化2、cDNA测序对人类g组中能转录表达的序列（即g）进行测定。2%【概括序列图过程（两种技术路线）（参考）： （1）公共序列路线：即在物理图基础上，将各个BAC克隆片段切成更短的片段，形成亚克隆分别进行测序，再将相互重叠的读出序列组装成连续重叠线。 （2）“鸟枪法”测序路线：即直接将基因组DNA分割成20kb左右的小片段进行随机测序，再用超级计算机组装成重叠线。所形成的序列图称celera序列。 ACGTCCGATCGGTTCATGCC TCGGTTCATGCC

9、AATGCCGTCC】14（2）人类g组测序1、2001-2-15，6国完成人类g组工作草图。95%2、2000-4-6，Celera，某男g组序列，99%3、1999-12，英、日、美、加、瑞科学家完成22号CS测序（33.4Mb），545g、134假g。4、2000-4，日、美、德完成21号CS测序。5、2004.10，公布人类基因组计划完成图。2006.5.18，英美完成1号CS测序，2.23亿bp，3142个基因，基因突变与350中疾病有关。15（四）基因图（gene map)据序列图，用不同方法预测出基因所在位置的图。方法：（一）CpG岛的应用CpG岛指每个基因5端转录起点处富含Cp

10、G的一段DNA。故，测序中，每发现一CpG岛，即意味此处有一基因。（二）计算机的应用用计算机预演系统GRAIL可从未知DNA中确认外显子。（三）cDNA策略 分离出mRNA，反转录成cDNA片段，此为表达序列标签（expressed sequence tag,EST),定位后构成的图称转录图(transcriptinal map,又称表达图expression map)（基因图雏形）据此可估计基因组中基因数。人基因组中基因数：2-2.5万。不同个体间基因编码差异：0.01%一、人类基因组多样性计划（human genome diversity project，HGDP）人类基因数量约2-2.5

11、万个人类基因组DNA含3109bp不同个体基因编码仅有0.01%差异种族多样性族群多样性个体特异性人类基因组的多样性与同一性二、功能基因组学功能基因组学（functional genomics）概念：研究基因组多样性、表达调控、对蛋白质表达和功能的研究、模式生物基因组的研究等。转录图基因表达图：三维转录图。 不同时间不同基因不同表达水平不同发育期不同组织不同表达水平同一组织同一基因三、比较基因组学（comparative genomics）各种模式生物基因组序列的比较生物种类 基因组大小 预测基因组数目 基因平均长度 大肠杆菌4.6Mb 1800 约1kb 酵母 12Mb 5800 约2kb

12、秀丽线虫 97Mb18500 约5.3kb 果蝇 116Mb 13600 约10kb 小鼠 3000Mb40000约30kb 人 3164Mb 2-2.5万27kb 生物基因组进化的连续性分析 21%的基因原核生物和真核生物共有 32%的基因真核生物共有而原核生物没有 24%的基因动物所共有 22%的基因脊椎动物特有四、环境基因组学（enviromental genomics）是研究与环境因素相关的疾病易感性基因的。环境相关的疾病易感基因基因多态性 分类 环境成份 相关疾病 CYP1A1 激活吸烟 肺癌GST 解毒 吸烟 肺癌NAT2 解毒吸烟 膀胱癌、乳腺癌 TCF2转录因子母亲吸烟 唇裂、

13、腭裂ALAD 生物合成 铅 铅中毒 五、疾病基因组学（morbid genomics） 主要任务是分离重要疾病的致病基因与相关基因，并确定其致病机制。1.肿瘤癌基因和抑癌基因的定位与克隆；2.单基因病致病基因的定位与克隆；3.多基因病数量性状基因座（QTL）的定位与克隆。七、生物信息学（bioinformatics） 是生物学与计算机科学和应用数学交叉的一门新兴学科，对生物学实验数据的获取、加工、存储、检索与分析，进而达到揭示数据所含的生物学意义有重要作用。 国际上三大公共基因数据库： Gene Bank：美国国家生物技术信息中心（NCBI） EMBL：美国欧洲生物学信息研究所（EBI） DD

14、BL：日本信息生物学中心（CIB） 生物信息学已改变了基础生命科学研究的运作方式，极大地提高了工作效率。一、基因定位工作历史主要方法 连锁分析（linkage analysis） 体细胞杂交（somatic cell hybridization） 原位杂交（hybridization in situ） 放射杂种（radiation hybrid） 计算机识别（computer identify）1连锁分析 同一条染色体上的不同基因呈线性连锁关系，在减数分裂后，结合家系分析，可鉴定子代中的重组体，通过重组值计算，可推断待定位基因与已定位基因间的连锁关系和遗传距离，而实现基因定位。两个基因如非连锁

15、，则重组值=50%，即随机组合。减数分裂产生配子发生交换AbaBAbaBABABabababaBABAb两个基因如连锁，则重组值50%，且重组值与遗传距离成正比。 2.体细胞杂交 人/鼠融合细胞的特点： 融合细胞兼有有双亲细胞染色体，但鼠一方染色体一般全部保留，而人一方染色体在细胞增殖过程中优先丢失，以至最后仅剩少数几条，乃至1条人染色体是基因定位的好材料。结合染色体显带和生化分析技术，可把某些生化性状决定基因定位在保留的一条染色体上。杂种细胞克隆嵌板杂种克隆 保留的人类染色体 12345678A+ B+ + C+ + + + 3.原位杂交 是核酸分子杂交技术在基因定位中的应用。用经放射性同位

16、素标记的探针，同染色体标本载玻片上原位变性的染色体DNA进行分子杂交，通过放射自显影来检测与探针杂交结合的染色体同源序列，依据放射性探针在染色体上的显影位置进行基因定位。 荧光原位杂交（FISH）4.放射杂种 是用射线辐射人体细胞染色体，使其随机片段化，再与鼠细胞融合，形成人/鼠细胞放射杂种，人的随机染色体片段，整合入鼠细胞染色体中。构建放射杂种细胞系克隆嵌板，可用于基因定位。二、基因克隆基因克隆的三种策略： 功能克隆（functional clonins） 定位克隆（positional clonins） 候选克隆（cardidate clonins） 1.功能克隆根据目的遗传性状的特征，分

17、析决定基因的功能，推测有关蛋白质。分析纯化这一蛋白质，并测出部分氨基酸顺序。根据遗传密码推测可能的mRNA序列。设计相应的寡核苷酸探针，杂交筛选cDNA或基因组DNA文库，最终获得决定基因的基因克隆。 2.定位克隆收集目的遗传病的家系，选择遗传标记进行连锁分析，建立目的遗传病与基因组中某染色体区域中遗传标记的连锁关系。根据这一位置信息，将遗传图中初步确定的位置，转变成物理图中相应区域的DNA“邻接克隆群”。从相应区域的“邻接克隆群”中筛选可表达的结构基因，作为候选基因；在若干个候选基因中进行转录表达和突变鉴定分析，最终将目的遗传病的决定基因精确定位和分离克隆该基因。定位克隆(positional clo