细胞生物学研究思路基础医学课件

1、细胞生物学研究思路基础医学细胞生物学研究思路基础医学细胞生物学研究思路基础医学 细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组成员黄辰教授博士 侯妮 讲师 博士刘利英高级实验师博士 杨娟 副教授 博士陈妍珂副教授博士赵凌宇讲师博士刘颖勋讲师博士秦棪楠讲师博士郭波讲师博士王鲁敏讲师博士王晓霏实验室硕士细胞生物学研究思路基础医学细胞生物学研究思路基础医学细胞生物 细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组成员黄辰教授博士 侯妮 讲师 博士刘利英高级实验师博士 杨娟 副教授 博士陈妍珂副教授博士赵凌宇讲师博士刘颖勋讲师博士秦棪楠讲师博士郭波讲师博士王鲁敏讲师博士王晓霏实验室硕士 细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组成员黄辰 侯

2、妮刘 细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组研究平台实验室建设模块大型仪器检测室普通功能实验室动物饲养室形态学检测细胞生物学分子生物学流式细胞仪激光共聚焦显微镜图像分析系统定量PCR膜片钳蛋白组学芯片点样杂交系统激光捕获显微切割系统小动物活体成像系统动物行为学 细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组研究平台实验室建设模 细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组实验环境 技术集成（开设高端生物医学实验课程） 一站式的科研基地（实现功能实验室与大型仪器联动） 严格管理与人性化统一 宽松学术氛围与严谨科学态度 细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组实验环境 技术集成（ 细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组研究方向心理应激与疾病

3、建立了恐惧声音心理应激模型 探索了心理应激与肿瘤发生关系 探索了心理应激对学习记忆的生物学效应 探索了心理应激对雄性生殖的生物学效应 细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组研究方向心理应激与疾 细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组研究方向2.肿瘤发生发展机制 非编码RNA与肿瘤的关系 肿瘤的表观遗传学调控机制（MECP2） RNA结合蛋白、mRNA与非编码RNA的相互作用在肿瘤中 的网络调控 细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组研究方向2.肿瘤发生 细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组研究方向3.生物标志物筛选 肿瘤血清标志物的筛选 自闭症血清标志物的筛选 高原习服标志物的筛选 细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组

4、研究方向3.生物标志 细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组研究方向4.糖修饰组学在疾病中的作用 肿瘤糖修饰组学 自闭症糖修饰组学 高原习服糖修饰组学 细胞生物学与遗传学-肿瘤研究小组研究方向4.糖修饰组 科学研究是科学工作者的幸福源泉幸福就在于人的感性生活，在于感性欲望的满足与快乐。幸福的过程有神经递质的释放（多巴胺与内啡肽）。科学研究的幸福可以自我掌控。 科学研究是科学工作者的幸福源泉幸福就在于人的感性生活，在于为什么科学研究是一种痛苦？课题死了么？ 1. 结论已经发表 2. 推理已经证实 3. 技术已经应用 4. 实验无法实现 5. 时间不够用发散思维为什么科学研究是一种痛苦？课题死了么？发散

5、思维从科学的痛苦到科学的幸福的基础创新性可读性信息量文献内容解决问题创新之处意义所在技术实现文章理念文献内容是否支持作者观点自身研究研究方向最终目标实验技能课题技巧思考消化从科学的痛苦到科学的幸福的基础创新性可读性信息量文献内容自身 如何将科学研究的痛苦变成幸福？跟踪性研究思路横向移植的研究纵向连接的研究ABEACEADEAB源头跟踪模仿BC源头跟踪模仿ABC将科学研究变得简单 如何将科学研究的痛苦变成幸福？跟踪性研究思路横向移植的研究 研究思路跟踪性研究思路 发现某基因在肝癌组织中表达增高，并有很多机制研究样本差异 查文献后，确定在乳腺癌中尚无人涉及。SCI处女作出炉：某基因在乳腺癌组织中表

6、达增高。已发表内容自身研究内容 研究思路跟踪性研究思路 发现某基因在肝癌组织中表 研究思路跟踪性研究思路 发现辛伐他汀有某种作用，能够治疗某种临床疾病，且对其原理进行了研究，找到了相关基因。 药物处理差异 联想到了阿托伐他汀。SCI处女作出炉：阿托伐他汀对某疾病的治疗效果及其作用机制。 已发表内容自身研究内容 研究思路跟踪性研究思路 发现辛伐他汀有某种作用， 研究思路跟踪性研究思路 发现某基因具有抗氧化应激的作用机制相似性 联想到氧化应激在好多疾病的病理机制中都发挥作用，比如糖尿病肾病、糖尿病神经病变等等。SCI处女作出炉：某基因在糖尿病肾病中的作用。 已发表内容自身研究内容 研究思路跟踪性研

7、究思路 发现某基因具有抗氧化应激 研究思路跟踪性研究思路 发现A基因具有某种作用。信号通路 联想到A基因的上游或下游基因是B基因，是否也有这种作用？SCI处女作出炉：B基因具有某种作用。 已发表内容自身研究内容 研究思路跟踪性研究思路 发现A基因具有某种作用。 研究思路跟踪性研究思路问题1：肿瘤的表观调控 研究思路跟踪性研究思路问题1：肿瘤的表观调控 研究思路跟踪性研究思路问题2：MeCP2在胃癌中的作用如何？ 研究思路跟踪性研究思路问题2：MeCP2在胃癌中的作用 研究思路跟踪性研究思路问题3：什么分子调控了MeCP2？ 研究思路跟踪性研究思路问题3：什么分子调控了MeCP2 研究思路跟踪性

8、研究思路问题4：MeCP2调控了什么分子？染色质免疫共沉淀(CHIP-on-chip) 研究思路跟踪性研究思路问题4：MeCP2调控了什么分子 研究思路跟踪性研究思路假设与结果 研究思路跟踪性研究思路假设与结果 研究思路跟踪性研究思路 发现某种药物能够对TNF-产生影响。家族基因 拜读大作后，联想到IL-6以及CRP都是炎症因子，有可能这种药物对IL-6以及CRP也有影响。SCI处女作出炉：某种药物对IL-6以及CRP的影响。 已发表内容自身研究内容 研究思路跟踪性研究思路 发现某种药物能够对TNF 研究思路基于技术跟踪的新探索各种组学不同样本不同处理生物信息分析靶分子验证问题的解释 研究思路

9、基于技术跟踪的新探索各种组学不同样本不同处理生 研究思路基于技术跟踪的新探索收集临床样本RNADNAProteinmicroRNA芯片基因芯片组织芯片RT-PCR或Real-time PCRWestern-blot免疫组化基因表达差异确定目的基因参考文献microRNA研究 研究思路基于技术跟踪的新探索收集临床样本RNADNAP 研究思路基于技术跟踪的新探索问题1：自闭症诊断困难兴趣范围狭窄和刻板的行为模式语言交流障碍社会交往障碍 研究思路基于技术跟踪的新探索问题1：自闭症诊断困难兴趣 研究思路基于技术跟踪的新探索问题2：自闭症的遗传因素复杂 研究思路基于技术跟踪的新探索问题2：自闭症的遗传因

10、素复 研究思路基于技术跟踪的新探索问题3：为什么自闭症有共同的特征？ 研究思路基于技术跟踪的新探索问题3：为什么自闭症有共同 研究思路基于技术跟踪的新探索问题4：如何寻找自闭症的生物标志物？生物芯片或磁珠化学芯片或磁珠疏水芯片 阳离子交换金属芯片亲水芯片 抗原- 抗体受体-配体DNA-Protein阴离子交换PS10 or PS20 研究思路基于技术跟踪的新探索问题4：如何寻找自闭症的生Choose diseaseBoth tumor patients and health controls Collecting samplesserumSample quality is very impor

11、tant Blood samples were collected by trained phlebotomist, and processed within a few hours according to a standard protocol. Aliquots of sera for mass spectrometric analysis were frozen at -80 immediately after processing.Separation proteins by The liquid chip ClinProt BeadsClinProt BeadsClinProt B

12、eadshydrophobicityMB-HIC 1MB-HIC 3 MB-HIC 8MB-HIC 18weak anion and weak cationMB-WCXMB-WAXmetal ions MB-IMAC-FeMB-IMAC-CuChoose diseaseCollecting samplMass spectrum analysisMass spectrum analysis峰质量变化倍数基因名称鉴定序列43881.971.78SERPINA5SARLNSQRLVFNRPFLMFIVDNNILFLGKVNRP64089.211.61FGAGDSTFESKSYKMADEAGSEADH

13、EGTHSTKRGHAKSRPV84208.051.73ASLFVAEFLFWASLCM*THLSRM*AEDLILYCTKEFSFVQ表1 串联质谱鉴定的可能的ASD相关蛋白 l研究结果峰质量变化倍数基因名称鉴定序列43881.971.78SER新的问题或未解决的问题所有技术为我所用 研究思路基于新现象观察下的新探索新的问题或未解决的问题所有技术为我所用 研究思路基于新现 基因功能的分析基因功能研究目的基因表达调控细胞水平动物水平活性周期运动分化衰老凋亡.模式动物药物处理临床样本收集组织水平动物组织稳定细胞系药物处理成瘤实验.免疫组化qPCRWB. 基因功能的分析基因功能研究目的基因表达调控

14、细胞水平动物水平 按照论文结构的实验设计分子准备工作、前期初步实验结果引入细胞/组织水平现象作用机制切入作用机制深入可选：模式细胞/动物验证旁通机制临床样本验证模式图 Diagram123456qPCRWBWBWBRNAiIFFCMIHCDrugsMorphology 按照论文结构的实验设计分子准备工作、前期初步实验结果引入细 基因突变与沉默技术RNAi1990年，Jorgensen将色素的基因导入矮牵牛(petunias) ，发现了共抑制现象 (cosuppression)。1995年，Guo等应用par I基因的反义RNA处理线虫产生了par I 基因功能缺失型或基因敲除型的表型。1998

15、年，Fire 和 Mello 证实Guo发现的正义RNA或反义RNA诱导基因表达抑制是由微量dsRNA 而引起。提出RNA干涉(RNA interference, RNAi)的概念。 基因突变与沉默技术RNAi1990年，Jorgense 基因突变与沉默技术RNAiDouble-stranded RNAinjectC. elegansNeg. control UninjectedAntisense RNA dsRNAsenseantisenseNature 1998 391:806-811Mex-3 mRNA detection in embryos by in situ hybridizat

16、ionAndrew Z. Fire (Stanford University photo) Craig C. Mello (University of Massachusetts Medical School ) 基因突变与沉默技术RNAiDouble-strande 基因突变与沉默技术RNAidsRNA22nt siRNAstargetmRNAsecondary siRNAsamplificationprocessingdegradationrecognitioncopying+processingspreading 基因突变与沉默技术RNAidsRNA22nt siR 基因突变与沉默技术R

17、NAiC. elegansDrosophilaArabidopsisamplificationprocessingdegradationrecognitioncopying+processingspreadingDICERDCR-1CAFAGO2RDE-1AGO1RISCSID-1RRF-1SDE-1/SGS-2RDE-4VIGCG1800Fmr1 基因突变与沉默技术RNAiC. elegansDros 基因突变与沉默技术RNAiC. elegansDrosophilaArabidopsisamplificationprocessingdegradationrecognitioncopying

18、+processingspreadingDICERDCR-1CAFAGO2RDE-1AGO1RISCSID-1RRF-1SDE-1/SGS-2RDE-4VIGCG1800Fmr1 基因突变与沉默技术RNAiC. elegansDrosInitiation StepATPATPADP + ppiADP + ppiDICERKINASERdRPInitiation StepATPATPADP + ppiDicerDicersiRNA5353RISCsiRNA5353RISCEffector StepsiRNA bindingsiRNA unwindingRISC activationEffecto

19、r StepsiRNA binding 基因突变与沉默技术RNAi研究案例小英家系小英的心电图显性负效应 基因突变与沉默技术RNAi研究案例小英家系小英的心电图 基因突变与沉默技术RNAi研究案例 基因突变与沉默技术RNAi研究案例 基因突变与沉默技术RNAi研究案例 基因突变与沉默技术RNAi研究案例 基因突变与沉默技术RNAi研究案例 基因突变与沉默技术RNAi研究案例 基因突变与沉默技术RNAi研究案例Heart Rhythm. 2013, 10（1）：128136 基因突变与沉默技术RNAi研究案例Heart Rhyt 基因突变、敲除与沉默技术ZFNs技术 锌指核酸酶是锌指蛋白和Fok

20、I核酸内切酶的剪切结构域组成的嵌合融合蛋白, 其锌指蛋白结构域负责识别靶位点, 依赖FokI的作用打断DNA双链, 从而造成双链断裂，断开的双链DNA在修复过程中会发生碱基的缺失、插入、同源交换等突变。 基因突变、敲除与沉默技术ZFNs技术 锌指核酸酶 基因突变、敲除与沉默技术ZFNs技术锌指核酸酶：锌指蛋白Fokl+识别区域酶切区域靶点选择受限。“上下文效应” 。Off-targeting现象严重 。ZFNs 的合成组装技术难度大。 基因突变、敲除与沉默技术ZFNs技术锌指核酸酶：锌指蛋 基因突变、敲除与沉默技术TALENs技术2009 年，Boch等和Moscou等破解黄单胞菌效应子蛋白

21、TALE（transcription activator-like effectors）与寄主靶基因 DNA特异性识别分子密码。2011年Sangamo BioSciences公司和哈佛大学的两个研究小组分别利用TALENs技术进行了基因组靶向修饰相关研究。 基因突变、敲除与沉默技术TALENs技术2009 年， 基因突变、敲除与沉默技术TALENs技术TALE nuclease结构DNA识别区（TALE蛋白）：TALE蛋白是由植物病原体黄单胞菌属分泌的一种蛋白,能特异性的识别并结合 DNA 序列。剪切结构域（Fokl）：Fokl则可通过二聚化产生核酸内切酶活性, 在该序列附近造成 DNA 的

22、双链断裂(Double-stand break, DSB)。 基因突变、敲除与沉默技术TALENs技术TALE nu 基因突变、敲除与沉默技术TALENs技术TALE蛋白TALE蛋白是由12个或以上特异性识别DNA的串联“蛋白模块”和两侧的N-末端及C-末端序列组成。每个“蛋白模块”包含34个氨基酸，第12和13位残基是靶向识别的关键位点，被称作重复可变的双连氨基酸残基位点（Repeat Variant Di-residue, RVD） 。每个蛋白模块上RVDs对应识别一个碱基。 基因突变、敲除与沉默技术TALENs技术TALE蛋白T 基因突变、敲除与沉默技术TALENs技术Fokl 核酸内切

23、酶TALENsZFNsFokl酶只有形成二聚体时才具有酶切活性，所以每次必须设计一对TALENs，在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻（间隔17碱基）的靶序列（一般十几个碱基）分别进行TALE识别模块构建。TALENs和ZFNs使用相同的Fokl酶。 基因突变、敲除与沉默技术TALENs技术Fokl 核酸 基因突变、敲除与沉默技术TALENs技术基因敲除步骤- TALE 靶点识别模块构建 Four basic single-unit vectors 基因突变、敲除与沉默技术TALENs技术基因敲除步骤- 基因突变、敲除与沉默技术TALENs技术基因敲除步骤- TALE 靶点识别模块构建 基因

24、突变、敲除与沉默技术TALENs技术基因敲除步骤- 基因突变、敲除与沉默技术TALENs技术基因敲除步骤 TALENs质粒对共转入细胞后，其表达的融合蛋白即可分别找到其DNA靶位点并与靶位点特异结合。此时，两个TALENs融合蛋白中的FokI功能域形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，于两个靶位点之间打断目标基因。诱发DNA损伤修复机制，主要有非同源末端连接（NHEJ）和同源直接修复（HDR）。在此修过程中形成一定的插入或缺失突变，即形成目标基因敲除突变体。 基因突变、敲除与沉默技术TALENs技术基因敲除步骤 基因突变、敲除与沉默技术TALENs技术TALENs的优势TALE的核酸识别单元与A

25、、G、C、T有恒定的对应关系。靶序列识别模块不受上下游影响，特异识别并打断基因组中的任意靶序列。无基因序列、细胞、物种限制。毒性低、脱靶情况少。成对的TALE识别模块保证了基因敲除靶点的准确性。 基因突变、敲除与沉默技术TALENs技术TALENs的 基因突变、敲除与沉默技术TALENs技术TALENs的应用领域 基因突变、敲除与沉默技术TALENs技术TALENs的 基因突变、敲除与沉默技术CRISPR-Cas技术CRISPR-Cas：由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。 基因突变、敲除与沉默技术CRISPR-Cas技术CRI 基因突变、敲除与沉默技术CRISPR-Cas技术CRISPR结构CRISPR：clustered regularly interspaced short palindromic repeats 是一个特殊的DNA重复序列家族, 广泛分布于细菌和古细菌基因组中。CRISPR 位点通常由短的高度保守的重复序列组成, 重复序列的长度通常 21 48 bp, 重复序列之间被 26 72 bp 间隔序列隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列与靶基因进行识别。 基因突变、敲除与沉默技术CRISPR-Cas技术CRI 基因突变、敲除与沉默技术CRISPR-Cas技术Cas家族Cas（CRISPR asso