细胞生物学研究方法市公开课金奖市赛课一等奖课件

1、1 第三章细胞生物学研究方法郭兆峰10生物工程学号:104177306第1页2第一节 细胞形态结构观察方法 第二节 细胞及其组分分析方法 第三节 细胞培养与细胞工程 第四节细胞及生物大分子动态改变 第五节模式生物与功效基因组研究 学习内容第2页3第一节 细胞形态结构观察方法一、光学显微镜(light microscopy) （一）普通复式光学显微镜（二）相差显微镜和微分干涉显微镜（三）荧光显微镜（四）激光扫描共焦显微镜（五）其它二、电子显微镜(Electro microscopy)第3页4（一）普通复式光学显微镜1. 组成： 光学放大系统：目镜与物镜 照明系统：光源和聚光镜 机械装置：镜架和样

2、品调整系统2. 原理：物体经物镜形成倒立实像，经目镜深入放大成像。第4页50.61 分辨率 DN . sin/2=分辨率(resolusion)：区分两个质点间最小距离。其中: N=标本和物镜之间介质折射率； =入射光线波波长； =镜口角（样品对物镜镜口张角） Nsin/2称为物镜数值孔径第5页6显微镜几个光学特点：制作光学镜头所用玻璃折射率为1.651.78，所用介质折射率越靠近玻璃越好。sin /2最大值必定小于1；介质为空气，镜口率普通为0.050.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可靠近1.5。普通光线波长为400700nm，分辨力数值不会小于0.2m，人眼分辨力为0.2mm，所以显微

3、镜最大设计倍数为1000X。第6页71.原理：利用光衍射和干涉特征使相位差变成振幅差，表现为明与暗对比。2.两个特殊构件：环状光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。相位板（annular phaseplate）：涂有光吸收物质和相位推迟物质。3.用途：能观察无色、透明、活细胞中结构。（二）相差显微镜第7页8决定光学显微镜分辨率要素：物镜镜口角（），入射光波长（ ），介质折射率（N）A 两束光相位相同是，干涉使光振幅加强 ，B 相位相反是，干涉使光振幅减弱第8页91.原理：利用两组平面偏振光干涉，加强影像明暗效果，能显示结构三维立体投影。 微分干涉显微镜2.应用：适于

4、研究活细胞中较大细胞器、颗粒及其运动。计算机辅助DIC分辨率比普通光镜提升了一个数量级。应用这一原理制备录像增差显微镜（video-enhance microscopy）能够观察微管上颗粒运动。第9页10（三）荧光显微镜 Fluorescence microscope1.原理：以紫外线为光源照射被检物体，使之发生荧光，然后在显微镜下观察物体形态及其所在位置。2.特点：光源不直接照明，而是激发能源；需特殊滤色镜；分辨率高。3.用途：在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子定性、定位。既能够观察切片，也能够进行活体观察。有免疫荧光技术和荧光素直接标识技术。 第10页11荧光基本原理及其应用第11页12

5、（四）激光扫描共聚焦显微镜 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描,形成立体图像，可重构样品三维结构。能显示细胞样品立体结构。分辨力是普通光学显微镜3倍。用途类似荧光显微镜，但能够排除焦平面以外光干扰，增强图像反差和提升分辨率。第12页13 激光扫描共聚焦显微镜原理第13页14倒置显微镜 荧光共振能量转移技 (Fluorescence resonance energy transfer, FRET) (五)其它光学显微镜荧光漂白恢复技术第14页15二 电子显微镜第15页16用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。能显示细胞样品立体结构。分辨力是普通光学显微镜3倍。用途类似荧光显微镜，但能扫描不

6、一样层次，形成立体图像。（一） 原理第16页17第17页18以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束波长短，而且波长与加速电压(通常50120KV)平方根成反比。由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、统计系统、电源系统等5部分组成。分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。用于观察超微结构即小于0.2m、光学显微镜下无法看清结构，又称亚显微结构。电子显微镜优点第18页19显微镜分辨本事光源透镜真空成像原理光镜200nm可见光（400-700nm） 玻璃透镜不要求真空利用样品对光吸收形成明暗反差和颜色改变电镜0.1nm电子束（0.01-0.9nm）电磁透镜1.33x10-51.33x10-3Pa利

7、用样品对电子散射和透射形成明暗反差电镜与光镜比较第19页20（二） 主要电镜制样技术1. 超薄切片技术制作超薄切片流程： 固定 包埋 切片 染色通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐层脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进方式切片，重金属（铀、铅）盐染色第20页第21页222. 负染色技术用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网 上样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。第22页233. 冷冻蚀刻技术亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组

8、织溶掉，把碳和铂膜剥下来，此膜即为复膜第23页24第24页254. 电镜三维重构与低温电镜技术电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成含有主要应用前景一门新技术。电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学要硕士物大分子空间结构及其相互关系主要试验伎俩。 第25页265. 扫描电镜技术工作原理：是用一束极细电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子多少与样品表面结构相关，次级电子由探测器搜集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束强度，显示出与电子束同时扫描图像。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束

9、轰击下发出次级电子信号。第26页27扫描电镜原理示意图第27页28三 扫面隧道显微镜原理：依据隧道效应而设计，当原子尺度针尖在不到一个纳米高度上扫描样品时，此处电子云重合，外加一电压（2mV2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间距离有函数关系，将扫描过程中电流改变转换为图像，即可显示出原子水平凹凸形态。分辨率：横向为0.10.2nm，纵向可达0.001nm。用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。第28页29扫面隧道显微镜主要特点：含有原子尺度高分辨本事，侧分辨率为0.1到0.2nm，纵分辨率为0.001nm能够在真空、大气、液体等各种环境下工作非破坏性测量第29页

10、30第二节 细胞及其组分分析方法一 超离心技术分离细胞组分二 细胞组分细胞化学显示方法三 特异蛋白抗原定位与定性四 细胞内特异核酸定位与定性五 定量细胞化学分析与细胞分选技术第30页31一 超离心技术分离细胞组分是分离细胞器及各种大分子基本伎俩。转速为1025kr/min离心机称为高速离心机。转速25kr/min，离心力89K者称为超速离心机。超速离心机最高转速可达100000r/min，离心力超出500Kg。第31页32差速离心：分离大小相差悬殊细胞和细胞器。沉降次序：核线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高基体核蛋白体。密度梯度离心：将分离细胞组分放在密度逐步增加、高溶解度性惰性物质形成密度

11、梯度溶液表面经过重力或离心作用使样品中不一样组分以不一样速率沉降。速度沉降主要用于分离密度相近而大小不一细胞组分等密度沉降用于分离不一样密度组分第32页33二 细胞组分细胞化学显示方法DNA：福尔根（Feulgen）反应紫红色多糖类：PAS反应黄色脂肪：苏丹III红色蛋白质：米伦（Millon）红色细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类、脂类等物质，利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合，显现出颜色来判断含量和分布技术第33页34金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。Schiff反应：醛基可使Schiff试剂中无色品红变为红色。用于显示

12、糖和脱氧核糖核酸。联苯胺反应：过氧化酶分解H202，产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。茚三酮反应：显示蛋白质。显示方法第34页35三 特异蛋白抗原定位与定性1、免疫荧光技术将免疫学方法与荧光标识技术结合起来研究特异蛋白在细胞内分布。惯用荧光素有异硫氰酸荧光素、罗丹明等。有直接免疫荧光和间接免疫荧光。第35页36A 直接免疫荧光标识技术：将荧光分子与抗体欧联后直接用于免疫标识技术B 间接免疫标识技术：先将抗体（称第一抗体）与抗原反应，然后加入与荧光分子相偶联抗第一抗体抗体（称第二抗体）。第36页372 免疫电镜技术将样品

13、进行特殊标识增强反差，从而进行亚细胞结构和分子定位。特点: 分辨率高依据标识方法不一样分为：免疫铁蛋白技术、免疫酶标技术和免疫胶体金技术。第37页38四 细胞内特异核酸定位与定性细胞内特异核酸定位与定性通常采取原位杂交技术原位杂交技术：用标识核酸探针经过分子杂交确定特异性核苷酸序列在染色体上或细胞中位置方法。第38页39A 免疫胶体金标识技术原理示意图，细菌蛋白A能够与胶体金结合，也和与胶体Fc端特异性结合B免疫胶体金标识显示膀胱上皮细胞膜蛋白分布第39页40免疫胶体金技术：胶体金是直径1-100mm金颗粒分散在水中形成金溶胶。特点：特异性强轻易识别分辨率高第40页41五 定量细胞化学分析与细

14、胞分选技术原理：包在鞘液中细胞经过高频振荡控制喷嘴，形成包含单个细胞液滴，在激光束照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可依据这些性质分选出高纯度细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计第41页42用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选一门技术。用于定量测定细胞中DNA、RNA或某一特异蛋白含量；测定细胞群体中不一样时相细胞数量；从细胞群体中分离一些特异染色细胞；分离DNA含量不一样中期染色体。第42页43A 流式细胞仪分选原理示意图B 显示流式细胞仪分析处于不一样相HaLa细胞试验结果第43页44第三节

15、 细胞培养与细胞工程细胞工程技术是细胞生物学与遗传学交叉领域，主要是利用细胞生物学原理和方法，结合工程学技术伎俩，按照人们预先设计，有计划地改变或创造细胞遗传性技术。主要内容包含：细胞融合、细胞生物反应器、染色体转移、基因转移、细胞及组织培养等。目标是取得细胞产品或利用细胞本身。第44页45（一） 动物细胞培养原代细胞 ：110代以内细胞原代细胞培养：提取健康动物组织块，剪碎用浓度与活性适中胰酶或胶原酶与螯合剂等将细胞分散给予良好营养液与无菌环境在培养中进行慢速转动或静止培养不论何种培养液都要加入一定量小牛血清第45页46贴壁培养：培养细胞贴壁生长，呈多态性，单层生长，保持接触抑制（conta

16、ct inhibition），也叫单层细胞培养。细胞系：能够传代40-50次而且仍保持原来染色体二倍体数量及接触抑制行为传代细胞。特点：有部分细胞遗传物质发生改变，有癌变倾向细胞株：经过生物学判定含有特殊遗传标识或性质细胞克隆第46页47连续细胞系（永生细胞系）：50代以后 、遗传物质发生改变、能够无限制传代培养下去特点：染色体显著改变，普通呈亚二倍体或非整倍体失去接触抑制，轻易传代培养A 正在分裂HeLa细胞B 长满单层CHO原代细胞第47页48试验室中惯用几个连续细胞系细胞系名称细胞类型起源3T3成纤维细胞小鼠HeLa宫颈癌上皮细胞Henrietta Lacks BHK21成纤维细胞叙利亚

17、仓鼠PtKl上皮细胞袋鼠L6成肌细胞大鼠PCI2嗜铬细胞大鼠SP2浆细胞小鼠SP20骨髓瘤浆细胞小鼠CHO卵巢细胞中国地鼠第48页49(二) 植物细胞培养单倍体细胞培养：花药在培养基上人工培养小孢子直接发育成胚状体，然后长成单倍体植株经过愈伤组织诱导分化出芽和根，最终长成植株原生质体培养：除去细胞壁细胞诱导分化长成植株用不一样植物原生质体进行融合与体细胞杂交，长成体细胞杂交植株第49页50细胞工程细胞工程基本技术主要包含：细胞体外培养细胞融合细胞器移植及细胞工程，就是应用细胞生物学和分子生物学方法，对细胞进行操作。 第50页51细胞融合：两个细胞融合成一个双核或多核细胞核现象动物细胞融合：灭活

18、病毒 (仙台病毒）或化学物质 (聚乙二醇 PEG)介导形成融合细胞。植物细胞融合：先用纤维素酶去壁电融合： 在高压电脉冲 (1-1.8kv/cm)下促使融合。（一） 细胞融合与单克隆抗体技术第51页52同核融合细胞：基因型相同细胞形成融 合细胞异核融合细胞：基因型不一样细胞形成融合细胞融合核细胞：经过细胞杂交形成单核子细胞第52页53单克隆抗体：高度均质性特异性抗体，由一个识别单一抗原表位B细胞克隆所分泌。普通来自杂交瘤细胞。 1975年英国人Kohler和Milstein创造，所以获1984年诺贝尔奖。原理：淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能无限分裂，而瘤细胞即使能够在体外长久培养，但不分泌

19、抗体。将这两种细胞融合得到杂交瘤细胞含有两个亲本特征，既能产生抗体又能无限增殖。第53页54操作过程：将小鼠髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫过小鼠脾细胞（B淋巴细胞）在聚乙醇或灭活 病毒介导下发生融合第54页55融合后杂交瘤细胞含有两种细胞特征一、能够分泌抗绵羊红细胞抗体二、像肿瘤细胞一样，能够在体外培养条件下或移植到体内无限增殖单克隆抗体主要优点：是能够用混合性异质抗原制备出针对某单一性抗原分子上特异决定簇同性质单克隆抗体。第55页56（二）显微操作技术与动物克隆细胞拆合物理方法：机械/短波光去核移入去核细胞中杂交细胞显微操作仪化学方法：松胞素处理细胞离心拆分细胞核体外包一层细胞膜和少许胞浆（小细

20、胞）PEG介导核体可同另一胞质体融合重组细胞可合成RNA和进行细胞分裂结合胚胎移植技术直接应用于育种第56页第四节 细胞及生物大分子动态改变（一） 荧光漂白恢复技术（FPR）用亲脂性或亲水性荧光分子与蛋白或脂质偶联，用于检测所标识分子在活体细胞表面或细胞内部运动及其迁移速率原理：利用高能激光束照射细胞某一特定区域，使该区域内标识分子发生不可逆淬灭，称为漂白区，伴随脂质分子或蛋白质运动，漂白区逐步恢复到原有水平第57页荧光漂白技术原理示意图第58页（二）单分子技术与细胞生命活动研究单分子技术是在细胞内实现观察单一分子运动规律技术，能够在纳米空间尺度和毫秒时间尺度上准确测量单个分子距离、位置、指向

21、、分布、结构以及各种动态过程分类：能够从工作原理或测量参数分类以工作原理分成单分子光谱及成像、单分子操作及力学性质测量优点：实时直接观察单个分子反应动力学路径测量单一分子间相互作用力捕捉单一分子随机过程和分子构象改变中间态测量稀发但主要信号和分布测量非平衡态和不一样时体系第59页（三） 酵母双杂交技术酵母双杂交系统巧妙地利用了真核生物转录调控因子组件式结构特征，因为这些蛋白质往往由两个或两个以上相互独立结构域组成，其中DNA结合结构域和转录激活结构域是转录激活因子发挥功效所必须。单独BD能与特定基因开启区结合，但不能激活基因转录，而由不一样转录调控因子BD和AD所形成杂合蛋白却能行使激活转录功效。第60页用于与检测蛋白质和蛋白质互做酵母双杂交技术原理示意图第61页（四） 荧光共振能量转移技术原理：在一定波长激发光照下，只有携带发光基团A供体分子能够被激发出波长是A荧光，而同一激发光不能激发携带发光基团B受体分子发出波长是B荧光，当吸收光谱A和 吸收光谱B重合，而且两个发光基团距离小到一定程度时会发生不一样程度能量转移，受体分子发出了波长是B荧光第62页荧光共振能量转移原理图第63页（五） 放射自显影技术原理：利用放射性同位素电离射线对乳胶感光作用，对细胞