基因工程的基本操作程序用课件

1、基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序基因工程培育抗虫棉的简要过程：提取棉花细胞(含抗虫基因)苏云金芽孢杆菌抗虫基因与运载体DNA拼接导入普通棉花(无抗虫特性)棉花植株(有抗虫特性)基因工程培育抗虫棉的简要过程：提取棉花细胞(含抗虫基因)苏云基因工程的基本操作程序（1）目的基因的获取（2）（3）将目的基因导入受体细胞（4）目的基因的检测与鉴定基因表达载体的构建基因工程的基本操作程序（1）目的基因的获取基因表达载体的构建一、目的基因的获取1、目的基因：主要指的是编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。2、获取方法：（1）从基因文库中获取目的基因；（2）利用PCR技术扩增目的基

2、因；（3）通过DNA合成仪用化学方法直接合成一、目的基因的获取1、目的基因：主要指的是编码蛋白质的结构基（一）从基因文库中获取目的基因1.什么叫基因文库？ 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因文库 基因组文库部分基因文库（cDNA文库）（一）从基因文库中获取目的基因1.什么叫基因文库？基因文库基基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库的比较基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库的补：原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点启动子终

3、止子 RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。 转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。 转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。补：原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游 编码不能转录为信使RNA，不能 编码蛋白质。：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质 编码区非编码区原核细胞的 基因结构有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中， 最重要的是位于编码区上 游的RNA聚合酶结合位点。非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 启动子终止子不能转录为信使RNA，不能：能转录相应的信使R

4、NA，能 补：真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子 外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子编码区上游 编码区下游 内含子： 外显子： 补：真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶内真核细胞的 基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点。非编码序列：包括非编码区和内含子真核细胞的 基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序结构基因外显子内含子转录、加工修饰mRNA结构基因外显子内含子转录、加工修饰m

5、RNA原核细胞真核细胞不同点编码区是_的编码区是间隔的、_的相同点都由能够编码蛋白质的_ _ 和具有调控作用的_ 区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码原核细胞真核细胞不同点编码区是编码区是间隔的、_的都基因组文库与部分基因文库的关系基因组文库与部分基因文库的关系基因组文库和部分基因文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少物种间基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以基因组文库和部分基因文库的比较文库类型cDNA文库基因组文库2.基

6、因文库的构建方法（1） 鸟枪法（2） 反转录法（3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法（人工合成） 注意多用于（2）（3）（真核生物）多用于原核生物2.基因文库的构建方法（1） 鸟枪法注意多用于（2）（3）（1）鸟枪法：供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶与载体连接受体细胞产生特定性状导入外源DNA扩增目的基因分离(直接分离法)（1）鸟枪法：供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶与 以目的基因转录成的信使RNA为模板，再反转录酶的催化下反转录成互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA，即cDNA，从而获得所需的基因。（2）反转录法（cDNA文库的构建方法） 以目的

7、基因转录成的信使RNA为模板，再（3）人工合成法： 根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成（3）人工合成法： 根据已知蛋白质的氨基酸序列上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点缺点鸟枪法反转录法根据已知氨基酸合成DNA法操作简便广泛使用工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因专一性强操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高专一性最强仅限于合成核苷酸对较少的简单基因上述三种目的基因

8、提取的方法有何优缺点？优点缺点鸟枪法反转录法思考： 如何从基因文库中得到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列； 基因的功能； 基因在染色体上的位置； 基因的转录产物mRNA； 基因翻译产物蛋白质等特性。注意：基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因。思考：依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列；注1、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的A、染色体DNA B、线粒体DNAC、总mRNA D、tRNA 2、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是A、某生物的全套基因就是一个基因文库B、将含有某种生物不同的许多DNA片段

9、，导入某个生物 体内，则这个生物就是一个基因文库C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库AC1、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的2、目的基因可从（2）利用PCR技术扩增目的基因PCR多聚酶链式反应 是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。（2）利用PCR技术扩增目的基因PCR多聚酶链式反应（二）利用PCR技术扩增目的基因（二）利用PCR技术扩增目的基因模板DNA95模板DNA95PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件

10、50引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件引物1引物2DNA引物72TPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件72第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件955072TaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件72第2轮结束 过程：变性、退火、延伸三步曲变性：加热

11、至9095双链DNA解链成为单链DNA退火：冷却至5560部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至7075以目的基因为模板，合成互补的新DNA链变性退火延伸 过程：变性、退火、延伸三步曲变性：加热至9095双链基因工程的基本操作程序用课件请回答基因工程方面的有关问题：(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为_。在第_轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。请回答基因工程方面的有关问题：(1)利用PCR技术扩

12、增目（1）从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为 。（2）在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。15/16三（1）从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术。 前提条件：_； 其它条件：_ 、 _、 _。原理：_方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）结果：多聚酶链式反应已知目的基因的核苷酸序列特定DNA片段DNA复制四种脱氧核苷酸DNA引物 DNA模板热稳定DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增体外 概念：PCR全称为_，是一项过程：a、DNA

13、变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。 c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从 引物的5端3端延伸，合成与模板互补 的_。 氢键单链DNA双链DNA链过程：a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板b、思考？1个DNA分子进行PCR扩增,循环4次，理论上至少需要几个引物？2（2n-1）(n为循环次数)（24-1）2=30思考？1个DNA分子进行PCR扩增,循环4次，2（2n-11、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分子片段为ATGTGTACAC，要使其数量增多，可用PCR技术

14、进行人工复制，复制时应给予的条件是 双链DNA分子为模板 ATGTG或TACAC模板链 四种脱氧核苷酸 四种核苷酸 DNA聚合酶 热稳定DNA聚合酶引物 温度变化 恒温A BC DD2、在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是A.540个 B.8100个 C.17280个D.7560个B1、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分子片段为AT1、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是A、化学合成法 B、基因组文库法C、cDNA文库法 D、聚合酶链反应2、下

15、列获取目的基因的方法中需要模板链的是从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 反转录法 通过DNA合成仪利用化学方法人工合成A B C DAD1、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是2、下3、目的基因主要是指_的结构基因。获得目的基因的常见方法有三种：（1）从基因文库中获取目的基因，根据基因的_序列，基因在_上的位置，基因的_产物mRNA，基因的_产物蛋白质等获取目的基因。（2）利用PCR技术扩增目的基因，该技术是一项在_完成的核酸合成技术，前提条件是有一段已知目的基因的_序列，以便于合成_。（3）如果基因较小且核苷酸序列已知，可以通过_方法。 编码蛋白质核苷酸染色体

16、转录表达体外核苷酸引物人工合成3、目的基因主要是指_的结构基因PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原 用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。 用_切断目 的基因，使其产生_ _。 将切下的目的基因片段插入质粒的_处， 再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶相同的黏性末端

17、切口DNA连接酶1.过程:二 基因表达载体构建 核心 用一定的_切割 将切下的目的基因片段插入质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种过程:质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个切口DNA连接酶重组DN2.基因表达载体的目的（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；（2）使目的基因能够表达和发挥作用。2.基因表达载体的目的思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？（P15） 不可以。 因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。 必须构

18、建上述元件的主要理由是：思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子（增强基因启动子工作效率的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都发挥作用。）等；（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基

19、因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动3.基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因3.基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动启动子：位于基因的首端的一段特殊结构的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来启动子：位于基因的首端的一段特殊结构的DNA片断，它是RN

20、A思考2：终止子的作用是什么？ 终止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。 是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。思考3：标记基因有什么作用？思考2：终止子的作用是什么？ 是为了鉴别受体细胞载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。注意用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。载体与表达载

21、体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DN三、将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。（一）转化： 目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程受体细胞稳定表达三、将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞： 有（二）方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射法感受态细胞（二）方法将目的基因导入将目的基因导入将目的基因导入农杆菌转1.将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法最常用基因枪法花粉管通道法1.将目的基

22、因导入植物细胞农杆菌转化法最常用（1）农杆菌转化法特点： 易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力原理： Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。（1）农杆菌转化法特点：原理：转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌转化过程:Ti质粒构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。（2）基因枪法适用于单子叶植物 基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将

23、（3）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。适用于被子植物（3）花粉通道法 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过2.将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）思考：为什么要用受精卵而不用体细胞？2.将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法（将基因表达（2）操作程序:提纯含目的基因表达载体取受精卵显微注射移植到子宫受精卵发育新性状动物（2）操作程序:提纯含目的基因表达载体取受精卵显微注

24、射移植到常用法：Ca2+处理常用菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA3.将目的基因导入微生物细胞思考：为什么要用Ca2+处理受体细胞？用Ca2处理，增加细菌细胞壁的通透性常用法：Ca2+处理常用菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：过受体生物 植物 动物 微生物受体细胞导入方法受精卵体细胞受精卵细胞/个体农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射技术用Ca2+处理成感受态细胞采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确的是（）A.将毒素蛋白注射到受精卵中B.将编码毒素蛋白的DN

25、A序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养C.将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵D.将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中BC受体生物 植物 动物 微生物受体细胞导入方法受精卵四、目的基因的检测与鉴定检测:是否插入目的基因是否转录是否翻译鉴定:分子水平鉴定个体生物学水平鉴定四、目的基因的检测与鉴定检测:1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 首先取出转基因生物的基因组DNA；（1）方法:DNA分子杂交（2）过程: 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针； 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂

26、交带,表明染色体已插入染色体DNA中。（一）检测1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 首先基因探针：是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列。 基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。 基因探针：是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因互补的DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。 DNA分子杂交示意图 采用一定的技术手段，将两种生物（二

27、）鉴定（个体生物学水平）2、检测目的基因是否转录出了mRNA3、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法:分 子 杂 交方法:抗原-抗体杂交过程:用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。（二）鉴定（个体生物学水平）2、检测目的基因是否转录出了mR提取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法抗原-抗体杂交苏云金杆菌Bt毒素蛋白将Bt毒蛋白注射小鼠体内从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体抗体蛋白质 出现杂交带脱分化组织培养提取（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法抗原-抗体杂交若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。怎样检验抗虫基因在棉

28、细胞内是否表达呢？没有抗虫基因的棉植株有抗虫基因的棉植株棉铃虫虫没有死虫被杀死没有表达目的基因表达若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。怎样检验抗虫基因在棉细胞类型步骤检测内容方法结果显示分子检测第一步目的基因是否进入受体细胞DNA分子杂交（DNA和DNA之间）是否成功显示出杂交带第二步目的基因是否转录出mRNA分子杂交技术（DNA和mRNA之间）是否成功显示出杂交带第三步目的基因是否翻译出蛋白质抗原抗体杂交是否成功显示出杂交带个体水平鉴定 包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度； 基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。目的基因的表达和检测类型步骤检测内容方法

29、结果显示分子检测第一步目的基因是否进入受提示： DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交； 抗原抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。提示：归纳: 基因工程的基本操作程序获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞转化法（微生物）、农杆菌转化法（植物）、显微注射法（动物）目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译归纳: 基因工程的基本操作程序获取目的基因 利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？ 有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，