基因组学 第3章 基因组结构的维持课件

1、第三章 基因组结构的维持与改变 基因组结构维持与改变基因组的相对稳定(维持)是物种生存的需要：依靠复制（模板依赖性）与修复基因组改变是进化的基础基因组改变的类型： 1)突变(mutation) 小范围序列改变 单个或几个核苷酸的替换、插入、缺失 来源于DNA复制错误或诱变破环。 2)重组(recombination) 大范围序列重建 同源重组、位点特异性重组、转座 来源于染色体内或染色体间序列的交换。 基因组改变与修复主要内容基因组复制突变与DNA修复重组与转座第一节 基因组复制DNA复制的三种可能途径半保留复制的实验证明Meselson-Stahl实验（1）在含有15NH4Cl的培养基中培养

2、大肠杆菌将细菌转移到正常培养基（含14NH4Cl）分别于细菌分裂一次和两次后取样，密度梯度离心拓扑异构酶解旋酶解决了拓扑问题催化断裂-再连接反应的酶。在DNA分子一条或两条链上形成切口，通过切口解开螺旋。在复制过程中拓扑异构酶解旋DNA双螺旋以半保留模式为主体的不同复制形式替代复制滚环复制复制起始双向复制基因组中形成两个复制叉（复制眼），分别以一条链为模板，双向复制每条链复制中，DNA合成方向相同：5到3两条链复制行进的方向相反基因组结构与复制起点复制起始存在着固定的位点，复制起点(origin of replication)细菌：环形基因组只有单一的复制起点真核生物：线性基因组存在多个复制起

3、点 酵母：332个 人类：20000个酵母复制起点自主复制序列ARS，不足200bp含四个具相似序列的亚结构域： A+B1 起始识别序列约40bp，为起始识别复合物（ORC)结合部位 B3与大肠杆菌复制起点相似 结合ARS结合因子（ABF1)，从而使B2的双螺旋结构解开高等生物复制起点目前仍难以确认将某些复制起始区域转入复制缺陷性质粒后不能重建复制能力存在酵母ORC蛋白同源基因复制延伸在复制起点形成复制叉母代双链中一条连续复制，称前导链；一条不连续，称滞后链（半不连续）DNA聚合酶引物参与DNA复制的DNA聚合酶细菌5个，其中DNA聚合酶III是复制酶真核生物9个，其中DNA 聚合酶是复制酶前

4、导链连续合成，后滞链非连续合成合成方向：5到3滞后链合成中，最初形成一些短的片段，称冈崎片段细菌冈崎片段长约1000-2000个核苷酸，真核生物的冈崎片段则短得多，少于200个核苷酸模板依赖性的DNA聚合酶需要引物来启动单链上的DNA合成 非连续合成中的引物与引发酶RNA引物：DNA聚合酶不能作用于无引物的单链模板，而RNA聚合酶可以细菌中引发酶（primase）合成4-15bp的引物引发酶不是转录酶大肠杆菌复制需要多种蛋白的协作拓扑异构酶、解旋酶(DnaB)：解旋DNA聚合酶III：复制引发酶；提供引物单链结合蛋白（SSB)：稳定打开的双链 连接酶：连接冈崎片段其它蛋白 大肠杆菌复制中解旋酶

5、的作用DnaB是大肠杆菌中复制相关的主要解旋酶 ，是一种5-3解旋酶它可以沿后滞链移动，同时使碱基对断裂另外两种3-5解旋酶：PriA、Rep拓扑异构酶解除解旋所产生的扭转张力引发小体（primosome）与复制体（replisome）引发小体,复制起始中，解旋酶结合到起点以后形成引发前复合物，然后引发酶结合，形成引发小体。引物合成后，由DNA聚合酶III二聚体来延伸。DNA聚合酶III二聚体与引物小体结合称为复制体。大肠杆菌复制中完成滞后链合成的方式复制酶DNA聚合酶III不具备5-3外切酶活性，到达下一个冈崎片段末端的RNA引物时停止DNA聚合酶I和RNaseH共同作用去除RNA引物，代之

6、以DNA 真核生物中后滞链合成的方式RNaseH模型：RNaseH去除引物至其最后一个核苷酸，侧翼内切核酸酶(FEN1)去除最后一个核苷酸和部分DNA侧翼模型：DNA聚合酶和解旋酶使引物与模板间碱基对断开，并被推成分支，再有FEN1切除分支大肠杆菌基因组复制终止不允许发生的情况存在终止序列：Tus蛋白识别位点Tus蛋白的不同结合方向控制了复制叉是否能够通过真核生物线性DNA分子末端的维持：所复制的DNA分子可能变短的问题线性DNA分子的末端变短的原因真核生物DNA末端(端粒)由端粒酶合成人类染色体末端的延伸由端粒酶完成染色体末端延伸过程的完成端粒长度和衰老癌症有关Cell：庄小威揭示端粒功能新

7、机制第二节 突变与DNA修复复制中的突变复制中的自发错误 尽管DNA聚合酶存在校正能力，但是但突变仍不可避免 大肠杆菌的复制错误率 1/107 ，经修复后基因组复制总错误率降至1/1011-10 点突变 转换 嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶 颠换 嘌呤到嘧啶或嘧啶到嘌呤插入或缺失 出现在编码区 可能导致移码 其它区域 可能导致多态性（复制滑移） 物理和化学诱变导致突变化学： 1）碱基类似物替代标准碱基参与复制 5-溴尿嘧啶和2-氨基嘌呤 2）脱氨 3）烷化 4）嵌入 溴化乙锭物理： 1）紫外辐射 形成嘧啶二聚体 2）电离辐射 3）加热突变可能不影响基因组存在很多不影响基因组功能的突变沉默突变： 1）突

8、变在基因间非调控区域或基因间非编码区域，对整体基因组功能无影响的突变。可发生在人类基因组的98.5%。 2）编码区的突变不影响编码蛋白的氨基酸序列，同义突变 点突变对基因编码区的四种影响同义：突变后，由于密码子兼并性，而不影响所编码的氨基酸非同义：引起氨基酸的错误编码无义：引起过早终止通读：引起无法终止编码区的插入或缺失突变可能导致不同的影响插入或缺失的核苷酸是3的倍数，仅影响个别氨基酸，因此影响可能较小非3的倍数，将导致移码非编码区突变可能影响基因组的功能基因表达调控区域的突变： 顺式作用元件，如核心启动子、关键调节序列内含子剪接位点的突变： 如5剪接点DNA聚合酶确保DNA复制精确性的机制

9、核苷酸选择 聚合前选择正确的核苷酸校对 3到5外切酶活性，聚合后切除错配的核苷酸四类DNA修复系统直接修复 切除修复 针对诱变损伤错配修复 针对复制错误重组修复人类DNA修复基因切除修复主要修复系统，人类参与蛋白最多的修复系统碱基切除 单核苷酸切除 15个基因参与核苷酸切除 一段核苷酸切除 28个基因参与碱基切除修复DNA糖基化酶 切除碱基，产生无碱基（AP）位点AP内切核酸酶 产生单核苷酸切口DNA聚合酶 填补碱基DNA连接酶 连接断裂核苷酸切除与UvrAB修复系统错配修复中子代DNA的识别针对复制错误，所以发生与子代DNA分子一个问题：如何区分子代DNA分子?大肠杆菌中子代新生分子尚未甲基

10、化，从而可以区分甲基化位点： 5-GATC-3 A甲基化 5-CCA/TGG-3 C甲基化错配修复与Mut修复系统双链断裂修复比单链损伤严重可能由电离辐射和化学诱变产生也可能由重组产生也称为重组修复SOS应答回避是生存的一种方式修复难以进行时 绕过主要损伤位点，允许某些复制错误保留，继续复制第三节 重组与转座重组与进化重组，各种包括多聚核苷酸断裂和再连接的过程。没有遗传重组就没有进化重组使不利和有利的突变得以分离，使适者生存，因此是自然选择的遗传学基础。重组的一般类型-同源重组（一般性重组）位点特异性重组（同源区很短）转座同源重组（Homologous recombination）同源重组，也

11、叫一般性重组（general recombination）,发生在具有高度序列同源性的DNA片段之间。这些片段可处在不同染色体上，也可以是同一染色体的不同部分。真核生物中，发生于减数分裂时期，负责减数分裂中的互换。同源重组的Holliday模型交换连接分支迁移断裂Holliday结构分离重组是由于异源双链体DNA间发生断裂与重连两条双链DNA分子间的重组关键是单链的交换交换产生异源双链体DNA片段当双链体DNA的单链与相对应的另一双链体中的单链发生置换时，会产生一个分叉结构（Holliday结构）分叉迁移使交叉点移动，封闭切口两次（相互的）交换才能产生一个联合分子联合分子可以通过切开相接的链来

12、形成两条分开的双链体分子Holliday结构与重组体的形成重组体是否形成取决于参与交换的链在解离过程中是否被切开切开，则水平分离，基因组不是重组体，但包含异源双链体DNA不切开，则垂直分离，产生互相重组的基因组Holliday模型的缺陷与Meselson-Radding修正模式Holliday模型的缺陷：切口是如何出现在两条分子的同一位置的？单分子切口切口链侵入未打开的双螺旋，形成D-环被取代链断开，形成另一个分子上的切口修正：在两分子切口形成过程中引入交换的D环大肠杆菌重组系统：1）RecBCD形成单链切口 RecBCD具有核酸内切酶活性和解旋酶活性内切酶：于Chi位点切开单链 chi位点

13、5-GCTGGTGG-3解旋酶：使单链末端游离大肠杆菌重组系统2)RecA 链交换DNA聚合酶 填补间隙RuvA,B 分叉迁移RuvC 切除Holliday连接点Holliday模型修正后无法解释基因转换配子（AA)X配子（aa)合子（AAaa)单倍体孢子（A或a)正常情况：A/a=1/1基因转换：A/a不=1/1双链断裂模型单分子双链断裂外切酶使断裂扩大一个3端侵入未打开的双螺旋，形成D-环另一个3端链延伸相互移动形成双交换，即形成两个Holliday结构两个Holliday结构的解离可以解释基因转换位点特异性重组（site-specific recombination）同源重组是发生于两段

14、高度序列同源的DNA区域间，但是这种广泛同源的区域并不是重组的必要条件，该过程也能由两个只具有很短相同序列的DNA分子引发。这称为位点特异性的重组。DNA整合到大肠杆菌基因组中DNA整合到大肠杆菌基因组中参与的酶整合通过att位点，基因组中的attP位点和大肠杆菌基因组中的attB位点，之间的特异性重组进行。每个结合位点的中心有一个15bp的相同的核心序列：O序列。细菌基因组中O序列旁侧的可变序列为B和B； 基因组旁侧的可变序列为P和P。核心序列突变会导致att位点失活，旁侧序列突变只会降低重组效率。O序列位点特异性重组的三种类型DNA插入：一个DNA片段在特定位点插入。DNA片段缺失。DNA片段倒位。重组结果是造成DNA的插入、缺失还是倒位，由DNA分子或参与重组其它分子上的重组识别位点的结构决定。重组酶通过识别重组位点来发生重组每个重组位点由一对对称排列重组酶识别位点（recombinase recognition sequences）构成。识别序列中间所包围的是一个短的不对称序列，称为交换区（crossover region），DNA的断裂和重新连接就发生在这里。单个DNA分子上的两个位点可能反向重复（inverted repeat），也可能同向重复（direc