基因组测序原理课件

1、 基因组测序原理基因组测序原理第一代测序技术第二代测序技术第三代测序技术第一代测序技术1、化学降解法 在该方法中, 一个末端被放射性标记的 DN A 片段在 5 组互相独立的化学应中分别被部分降解,其中每一组反应特异地针对某种碱基。因此生成5组放射性标记的分子, 每组混合物中均含有长短不一的 DN A 分子, 其长度取决于该组反应所针对的碱基在原 D NA 片段上的位置。最后, 各组混合物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离, 再通过放射自显影来检测末端标记的分子。 准确性好，易掌握，但操作麻烦2、 双脱氧链终止法（Sanger法） 核酸模板在 DNA 聚合酶、引物、4 种单脱氧核苷三磷酸 ( d

2、NTP , 其中的一种用放射性 P32标记 )存在条件下复制时, 在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸 (ddNTP) , 因为双脱氧核苷没有3-OH, 所以只要双脱氧核苷掺入链的末端, 该链就停止延长, 若链端掺入单脱氧核苷, 链就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后, 分4个泳道进行凝胶电泳, 分离长短不一的核酸片段, 长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后, 根据片段 3 端的双脱氧核 苷,便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。操作简单，应用广泛。3、荧光自动测序技术 荧光自动测序技术基于Sanger原理,

3、 用荧光标记代替同位素标记, 并用成像系统自动检测, 从而大大提高了 D NA 测序的速度和准确性。4、杂交测序技术 不同于化学降解法和Sanger法, 而是利用 DN A 杂交原理, 将一系列已知序列的单链寡核苷酸片段固定在基片上, 把待测的 DN A 样品片段变性后与其杂交, 根据杂交情况排列出样品的序列信息。该方法检测速度快，但误差较大，且不能重复测定。第二代测序技术（合成测序）第二代测序流程：2、Solexa测序法： 使用的方法是克隆单分子阵列技术，将待测序的单个基因组 D N A 片段固定在载玻片表面不同的位置上随后 ,对这些单个的 D N A 片段同时进行复制 , 生成大量微小的

4、D N A 簇 (D N A cluster)。最后 , 在与Sanger测序方法类似的步骤中 , 分别采用 4 种不同颜色荧光基团标记的 4 种核苷酸单体 , 以及标准的微阵列光学检测系统 , 同时检测阵列中那些被固定D N A 链上的引物延伸过程。 Solexa 的测序技术可以同时分析数亿个单个 D N A 单链分子的序列 ,从而能够对个体进行完整的基因分型3、ABI/SOLID连接酶测序技术： 也被称作为连接测序 (sequenceing byligation) 。在该方法中,DNA片段文库生成以后 ,首先将短的DNA片段固定在微珠上,并通过乳液PCR进行扩增;然后将含有扩增后片段的微珠

5、以阵列的方式排布,再加入测序引物,与固定在每个微珠上的DNA片段中已知的起始序列发生结合。随后,向混合物中加入长度为8个碱基的荧光标记寡核苷酸探针。这些探针从3 端开始的第5个碱基为查询碱基 , 分别用 4 种不同的荧光标记表示A、G、T 或者C,共分为 4 组。如果一条带有正确互补序列的探针与DNA发生结合,DNA连接酶将把它与测序引物进行连接 , 使得它被固定在表面上,而其他结合得不够牢固的探针分子都会被洗去。接着 ,用激光来激发探针上的荧光标记分子 ,从而获得新结合上碱基的信息。最后, 将探针剩余部分和荧光标记切除 。在新一轮的测序过程开始时 ,重复连接、荧光检测和切除步骤 , 得到第

6、10 个碱基的信息。类似地 在第三轮中可以获取第15个碱基,第四轮中获取第 20个碱基 , 依此类推。4、 Ion Torrent测序技术 原理：利用每个碱基在聚合反应中都会产生一个质子，从而改变了测序池体中的pH值，而pH值变化则通过设置于每个池体底部的由集成电路构成专一的pH值传感器进行检测 。优点：无以伦比的快速、简捷易用的技术、强大的扩展性2、Nanopores新型纳米孔测序技术： 原理：单链DNA分子在电场作用下，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔，使得单个碱基与纳米孔内的环糊精作用，检测碱基通过纳米孔时的电流变化来实现测序。 由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，因而

7、可以在此基础上使用多种方法来进行高通量检测。优点：纳米级别的孔径保证了检测具有良好的持续性，测序的准确度 可达99.8%以上 ，对于长达1000bp的单链DNA分子、RNA分子或者更短的核酸分子而言，无需进行扩增或标记就可以使用纳米孔测序法进行检测，这使得便宜快速地进行DNA测序成为可能。三代测速技术的比较第一代测序技术： 凭借其长的序列片段和高的准确率, 适合对新物种进行基因组长距框架的搭建以及后期GAP填补, 但是成本昂贵, 而且难以胜任微量 DNA 样品的测序工作。第二代测序技术： 454 适合对未知基因组从头测序, 搭建主体结构, 但在判断连续单碱基重复区时准确度不高。Solexa具有

8、通量高、片段短、价位低的特点,适合于小片段如miRNA 的研究。 SOLID 具有双碱基编码系统的纠错能力以及较高的测序通量, 但无法在基因组拼接中的广泛应用。第三代测序技术：快速，直接测序，简洁易用，具有强大的扩展性。 基因组测序的应用与实践DNA水平的应用： 1、全基因组的测序 2、基因组重测序 3、宏基因组研究RNA水平的应用： 1、转录组测序 2、小分子 RN A 测序表观基因组学应用：1、转录因子结合位点测序 2、 DNA 甲基化测序 参考文献：岳桂东 高强 高通量测序技术在动植物研究领域中的应用 生命科学 2012年第42卷陈 勇 柳亦松 曾建国 ，植物基因组测序的研究进展 生命科学研究 2014.2杨晓玲 施苏华 唐恬新一代测序技术的发展及应用前景 生物技