稀土荧光探针检测多巴胺及类似物课件

1、稀土荧光探针检测多巴胺及类似物答辩人：袁洁导师：赵美萍 副教授2003年6月18日选题背景已有检测方法综述实验部分总结致谢儿茶酚胺的结构 及生理意义儿茶酚胺（catecholamine, CA）的种类、结构和生理意义神经递质在单细胞检测中的意义Dopamine（DA）瑞典神经药理学家Carlsson于1958年首次提出脑内多巴胺(DA)是独立的神经递质 正常值范围为血浆：888pmol/L； 尿：424-2612nmo1/24h。增高会引起嗜铬细胞瘤，心肌梗塞，糖尿病酮症酸中毒等一系列疾病。而其含量的降低会引起植物神经病变，帕金森病等。 Epinephrine（E）& nor epinephr

2、ine （NE） 在人体内的正常值 范围为 血浆：480pmo1/L； 尿：0-80nmo1/24h在人体内的正常值范围为血浆：615-3240pmol/L； 尿：0-590 nmol/24h稀土荧光探针检测儿茶酚类化合物的原理 单纯的TbCl3，Tb-DCTA体系和DOPAC在实验用的波长条件下(298nm,546.8nm)都没有荧光信号，可见体系发光是由于形成了Tb-DCTADOPAC三重络合物并发生了能量转移得结果。DOPAC的荧光图红：激发波长为279nm蓝：激发波长为298nmTbCl3的荧光图红：激发波长为298nm蓝：激发波长为240nm1.三元络合物的形成 三元络合物体系：1.

3、离子缔合三元络合物 2.金属离子先后结合两种配体形成三元络合物 TbDCTACAs体系：Tb与DCTA先行络合，然后Tb余下的空位再与CAs络合，形成三重络合体系 2.三元络合物发光机理(1) 配体受激后,单重态（S1）有三种方式退激： a. 产生荧光的辐射跃迁(S1-S0) b. 系间窜跃(S1-T1) c. 无辐射跃迁回基态(ISC) 三重态（T 1）也有三种退激方式： a. 产生磷光的辐射跃迁(T1-S0) b. 通过无辐射转移跃迁到Tb3的激发态(ET)，c. 无辐射跃迁回基态(T1S0)。2.三元络合物发光机理(2) 分子内能量转换效率的影响因素：1.配体最低的激发三重态（T1）能量

4、高于Tb的5D4能级的能量2.能量转移的速率大于三重态无辐射退激的速率3.从配体激发单重态向三重态系间窜跃的速率和几率相当高实验条件的优化稀土离子与第一配体的选择： 1. Eu3 + EDTA体系 ； 2. Eu3phen体系； 小结： 最终弃用这两个体系的原因，是其适用的pH范围太低，难以使DA的羟基充分解离形成三元络合物。实验条件的优化 稀土离子与第一配体的选择： 3. Tb3 + EDTA体系（1）： Tb:EDTA1:1（浓度均为2 mmol/L）, pH11, ex300 nm，em545 nm,加入甲醇（分析纯）、CsCl、TOPO等尝试敏化,无法得到满意 检测限，DA为105 m

5、ol/L 小结： 目前研究最多的体系，适用的pH相对于前两个体系有了很大提高，但是仍然未能达到文献报道的结果 ACDOPACFluro图 BCDA-Fluro图 实验条件的优化稀土离子与第一配体的选择： 4. Tb3 + DCTA体系 ： 20C 时， Tb3与EDTA的络合常数lgK1为17.93，而与DCTA的络合常数lgK1为20.20* 因此本体系可以在更高pH下存在，更利于三重络合物形成pH影响0.4 mmol/L Tb3DCTA，2105 mol/L DOPAC，横坐标为pH 0.2 mmol/L Tb3DCTA，4105 mol/L DOPAC溶液（色谱纯甲醇：重蒸水9：1），横

6、坐标为5 ml样品中10 mol/L NaOH的体积 表面活性剂的影响由于水分子对荧光有相当的猝灭作用，体系又是在水相中，因此尝试加入表面活性剂进行改进。期望荧光体系能够被包裹在表面活性剂形成的胶束中得到保护，起到敏化作用。共尝试加入了阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠，阳离子表面活性剂溴代十二烷基三甲胺和非离子表面活性剂TOPO。都未起到期望的对体系的改善作用。甲醇含量影响0.2 mmol/L Tb3DCTA，4105 mol/L DOPAC溶液 ，NaOH fixed重原子影响 重原子对于荧光体系有时也可起到敏化作用。实验尝试向体系加入了SrCl2，BaCl2，以及CsCl，其中CsCl的加入

7、对体系的荧光有明显得增强作用 ，最后选择CsCl浓度为0.1 mol/L。 实验操作 向5 ml比色管中依次加入前述Tb-DCTA溶液0.1 ml、10mo l/L NaOH溶液0.04 ml、10 mol/L CsCl溶液0.05 ml、色谱纯甲醇4.5 ml，混匀。在检测前再加入待测物，用重蒸水定容至5 ml，在激发波长为298 nm，发射波长546.8 nm处用0.5 cm比色池测定荧光强度。 实验结果 a. CDA Fluro图 b. CDOPAC- Fluro图 实验结果 被测物指标多巴胺（DA）3,4二羟基苯乙酸（DOPAC）邻二酚（儿茶酚）3,4二羟基苯甲酸线性范围8108 8106mol/L8108 8106mol/L 8108 8106mol/L 8108 8106mol/L 线性相关系数0.99880.99920.99670.9982检测限5.2108 mol/L3.6108 mol/L5.7108 mol/L2.97108 mol/L 1.证明了CAs 能够与Tb 和另一配体形成三重络合物并发出荧光。2. 建立了一个新的用稀土荧光探针检测儿茶酚类化合物的体系，并对实验条件进行了优化。3. 确定了新方法检测四种物质的线性范围和最低检