酶学实验技术课件

1、酶学实验技术第一节 概述第二节 酶的来源和生产第三节 酶和细胞的固定化第四节 酶的应用第一节 概述一、酶的特性酶：有催化能力的蛋白质酶促反应（酶催化反应）1961年按酶所催化的反应类型将酶分成6大类： 氧化还原酶类； 转移酶类； 水解酶类； 裂合酶类； 异构酶类； 合成酶（或称连接酶）类。二、酶学实验技术简介有机相中酶反应的研究；酶的分离、提纯、大批量生产及新酶和酶的 应用开发；酶和细胞的固定化及酶反应器的研究（包括酶传感器、反应检测等）；酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶（突变酶）的研究；第二节 酶的来源和生产利用微生物生产酶的优点是：一、酶的来源：主要是动植物和微生物微生物具有较强的适

2、应性，通过各种遗传变异的手段， 能培育出新的高产菌株。微生物繁殖快、生产周期短、培养简便，并可以通过 控制培养条件来提高酶的产量；微生物种类繁多，动植物体内存在的酶，几乎都 可从微生物中得到；二、酶的生产菌1、对菌种的要求：（4）能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。（3）稳定，不易产生变异退化，不易感染噬菌体；（2）不是致病菌；（1）产酶量、酶的性质、最好是胞外酶；菌种保藏机构和有关研究部门，从自然界中分离筛选菌样采集、菌种分离初筛、纯化、复筛和生产性能鉴定等。改良（如基因突变、基因转移和基因克隆）。2、生产菌的来源：3、目前常用的产酶微生物：大肠杆菌、枯草杆菌、啤酒酵母、青霉菌、 木霉菌

3、、根霉菌、链霉菌等。三 酶的制备（一） 生物提取蛋白质提取，采用保持活性的分离法大致步骤： 细胞破碎离心分离硫酸铵盐析透析凝胶过滤离子交换冷冻干燥2、纯化倍数：指提纯后与提纯前酶比活力 的比值。1、比活力： 单位质量酶产品中酶活力称比活力。比活力=总活力单位总蛋白mg数= U(或IU) mg蛋白（二）利用DNA重组技术改造和生产酶外源酶基因工程菌重组入优点：不受天然来源限制，迅速，且易于诱变改造酶产品酶反应几乎都在水溶液中进行，自然简便缺点是游离酶只能一次性使用，不仅造成酶的浪费，而且会增加产品分离的难度和费用，影响产品的质量；另外溶液酶很不稳定，容易变性和失活。原因：比水溶性酶更适合于多酶反

4、应。固定化酶的优点：可多次使用，酶的稳定性提高。酶与底物和产物易于分开，易于纯化，产品质量高；反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制；酶的利用效率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量减少；酶和细胞的固定化方法载体结合法交联法包埋法物理吸附法共价结合法离子结合法吸附法，包埋法，共价键结合法，交联法EEEEEEEEEEEEEEEEEEE吸附法共价结合法交联法包埋法（1）载体结合法物理吸附法：载体：无机载体、天然高分子、大孔型合成树脂、 疏水型的载体。缺点：酶与载体之间的结合力不强，酶易于脱落， 导致酶活力下降并污染产物。（1）载体结合法离子结合法：载体：多糖类离子交换剂和离子交换树脂，

5、如DEAE-纤维素等。缺点：结合力也比较弱，酶易脱落 （1）载体结合法原理：酶分子上的功能团，如氨基、羧基、羟基、咪唑基、巯基等和载体表面的反应基团之间形成共价键，因而将酶固定在载体上。共价结合法：优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落。缺点：反应条件剧烈，往往不能得到比活性高的固定化酶，甚至酶的专一性等性质也会发生变化。（2）交联法原理：用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物 的细胞与细胞之间交联的固定化方法。常用的交联剂有戊二醛等。缺点：反应条件强烈，固定化酶的酶活较低；优点：酶的稳定性提高。最常用的交联剂是戊二醛，它的二个醛基与酶分子的游离氨基反应形成schiff碱，彼此交联： CH=N-酶

6、-N=CH-(CH2)3-CH=N-酶=N=CH-交联方式NCH(CH2)3CHNNCH(CH2)3CHNCH=N-酶-N=CH-(CH2)3-CH=N-酶-N=CH-交联法常与吸附法或包埋法联合使用。如先使用明胶（蛋白质）包埋，再用戊二醛交联；常在被交联的酶溶液中添加一定量的辅助蛋白如牛血清白蛋白，以提高固定化酶的稳定性。（3）包埋法网格型、微囊型网格型中用的高分子有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等合成高分子和淀粉、明胶、胶原、海藻胶和角叉菜胶等天然高分子。网格型包埋法是固定化细胞中用得最多、最有效的方法。2、固定化酶的性质一般酶活力下降，可在固定化反应体系中加入 抑制剂、底物或产物以保护酶的活性中心。（1）酶活力的变化（2）酶稳定性的变化操作稳定性，半衰期在1个月以上，可以认为 其具有一定的工业应用价值；贮藏稳定性；对蛋白酶的稳定性。 热稳定性（3）酶学特性的变化底物专一性、最适pH、最适温度、米氏常数最大反应速度等，均可能发生变化。填充床反应器第五节 酶在医药工业中的应用一、固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸技术路线E.coli 斜面固定化细胞（颗粒状）青霉素G转化液滤液细胞6-APA培养明胶包埋-戊二醛交联过滤抽提填充床式反